利用間歇浸沒式生物反應(yīng)器(TIBs)進(jìn)行甘蔗組培及組培苗酚類物質(zhì)作用的研究.pdf

1、間歇浸沒式生物反應(yīng)器(TIBs)是近年來國際上新研究開發(fā)的一種用于植物組織培養(yǎng)和植物次生代謝產(chǎn)物研究的系統(tǒng)。大量的報道己證實(shí)此系統(tǒng)與傳統(tǒng)植物組培技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢。本文以甘蔗在TIBs組培快繁為基礎(chǔ)進(jìn)行了以下三個方面的研究:
　　 1.利用TIBs進(jìn)行甘蔗的組培快繁研究
　　 以ROC22和Badila的莖尖脫毒組培苗為材料,開展了利用TIBsi進(jìn)行組培快繁的技術(shù)體系的研究。結(jié)果表明:(1)利用TIBs進(jìn)行甘蔗組織培

2、養(yǎng)一代增殖是傳統(tǒng)方法的的10倍以上,其中Badila的增殖能力比ROC22強(qiáng);(2)兩個品種TIBs組培以到第3或者第4代繼代材料為宜;(3)兩個品種接種密度在10-15株/L培養(yǎng)基最有利于甘蔗組培苗的增殖和生長;(4)TIBs中6-BA濃度為0.5-1.0 mg/L時適合于增殖培養(yǎng),NAA濃度為4 mg/L時有利于根的誘導(dǎo);(5)兩個品種的浸沒間歇頻率在1 min/3 h時增殖和生長表現(xiàn)比較優(yōu)異,1 min/6 h時則有利于根的誘導(dǎo)和

3、根的生長;TIBs組培苗的總苗數(shù)移栽成活率低于傳統(tǒng)方法,而超過5 cm高的組培苗的移栽成活率都在85％以上,兩種培養(yǎng)方式的移栽成活率差異不明顯。
　　 2.TIBs甘蔗組培快繁過程中組培苗產(chǎn)生的多酚類物質(zhì)對組培苗生長的影響
　　 以Badila莖尖脫毒組培苗為材料,培養(yǎng)基中添加5 mg/L的抗壞血酸為處理,以正常組培為對照。利用Cdna-AFLP技術(shù)分析了兩種條件下甘蔗組培苗的基因差異表達(dá)。結(jié)果使用256對引物組合擴(kuò)增出

4、大約17400條帶,其中有64條處理與對照之間具有明顯差異,經(jīng)過對回收差異片段進(jìn)行反向Northern雜交驗(yàn)證排除假陽性后,50個片段的表達(dá)方式與Cdna-AFLP分析結(jié)果是一致的,即對照和處理之間的表達(dá)具有明顯的差異。有36條帶在對照(不添加抗壞血酸)中表達(dá)增強(qiáng),占總代數(shù)的72％;有8條帶在對照與處理在表達(dá)時間上不一致,占總帶數(shù)的16％,對照在培養(yǎng)15 d時表達(dá),而處理的在25 d時表達(dá);還有6差異條帶為添加抗壞血酸處理中表達(dá)減弱,占

5、總帶數(shù)的12％。對50條特異性片段回收,克隆并成功測序后所得的結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的所有序列進(jìn)行Blastx和Blastn比對分析,得到的序列信息按功能分類可以分為8類:與細(xì)胞代謝與發(fā)育相關(guān),20％;與脅迫反應(yīng)相關(guān),18％;與茉莉酸信號途徑相關(guān),10％;與苯基丙酸類合成路徑相關(guān),14％;與生長素類相關(guān),6％;與氧化反應(yīng)途徑相關(guān),6％;與乙烯信號傳導(dǎo)相關(guān),10％;未知功能基因,16％。
　　 3.利用TIBs進(jìn)行甘蔗組培快

6、繁過程中產(chǎn)生的多酚類物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)番茄抗青枯病的研究
　　 本試驗(yàn)利用TIBs進(jìn)行甘蔗Badila,組培快繁過程中產(chǎn)生的多酚類物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)番茄(亞蔬2301)抗青枯病的研究,主要分析了:(1)多酚類物質(zhì)的種類;(2)多酚類物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)番茄抗青枯病的過程中番茄體內(nèi)幾種保護(hù)酶(PAL、POD、SOD)、總酚含量和木質(zhì)素含量的變化;(3)多酚類物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)番茄抗青枯病的過程中番茄一些與抗性相關(guān)的基因表達(dá)情況。
　　 本試驗(yàn)采用固

7、相微萃取技術(shù)與硅烷衍生化法結(jié)合氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用聯(lián)用來分析培養(yǎng)基中多酚類物質(zhì)的種類,共得到6種多酚類物質(zhì),按其峰面積從大到小排列順序分別為:間丙烯酸苯酚;3-(2-含氧甲基苯酚)-2,4-二甲基戊醇;2-含氧甲基苯酚;2,6-二異丁基-4-甲基苯酚;4-4'-亞甲基(2,3,6-三甲基苯酚);4,4'-亞甲基聯(lián)苯酚。其中間丙烯酸苯酚為一種酚酸類物質(zhì),與水楊酸(SA)化學(xué)結(jié)構(gòu)式相似。
　　 TIBs進(jìn)行甘蔗組培快繁過程中組培苗產(chǎn)生

8、的多酚類物質(zhì)具有一定的誘導(dǎo)番茄抗青枯病的能力,對番茄的青枯病防治有一定的效果,接種青枯病菌的番茄經(jīng)過TIBs甘蔗組培快繁過程中組培苗產(chǎn)生的多酚類物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)處理后與未經(jīng)誘導(dǎo)處理的相比,提高了根和葉片中的PAL、POD、SOD活性,與其他處理相比這些保護(hù)酶出現(xiàn)的時間較早且維持時間較長;同樣經(jīng)過誘導(dǎo)處理后番茄根和葉片中的總酚含量和木質(zhì)素的含量也比未經(jīng)誘導(dǎo)處理的高。
　　 利用RT-PCR技術(shù)對選取的一些與抗性相關(guān)的基因片段的表達(dá)分析