六個(gè)小麥條銹病菌誘導(dǎo)的UniGene表達(dá)特性分析及TaLHY和TaNIT基因的克隆.pdf

1、條銹病(Puccinia striiformis f.sp. tritic)是我國(guó)小麥的主要病害，特別是在我國(guó)西部地區(qū)由于適宜的發(fā)病條件，使條銹病近年來(lái)成為該小麥生態(tài)區(qū)最嚴(yán)重的病害。條銹菌生理小種變異快，條銹病抗源匱乏，可利用的抗性基因較少和條銹病原菌與寄主植物互作及植物抗病機(jī)理復(fù)雜，分子機(jī)理尚不清楚是限制了抗條銹病新品種的培育的原因。因此，在不斷地發(fā)現(xiàn)新的抗性基因，快速培育具有持久抗性的突破性小麥新品種的同時(shí)，加強(qiáng)條銹病原菌與寄主識(shí)別

2、及植物抗病的分子機(jī)理研究，克隆抗條銹病及其相關(guān)基因，是推動(dòng)從根本上解決小麥條銹病威脅的關(guān)鍵。
　　 本研究在已經(jīng)構(gòu)建的小麥條銹菌條中32(CY32)誘導(dǎo)的抗條銹病品種川農(nóng)19(CN19)的抑制差減雜交(SSH-cDNA)文庫(kù)、并獲得了大量差異表達(dá)ESTs的基礎(chǔ)上，從中挑選出6個(gè)抗病相關(guān)的UniGene進(jìn)行了表達(dá)特性分析，利用RACE技術(shù)和電子克隆技術(shù)對(duì)其中的2個(gè)基因進(jìn)行全長(zhǎng)克隆研究，以期從轉(zhuǎn)錄水平探討條銹菌誘導(dǎo)的抗病反應(yīng)分子機(jī)理

3、和發(fā)掘抗條銹病相關(guān)基因。研究結(jié)果如下：
　　 1應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)對(duì)SSH-cDNA文庫(kù)中篩選的6個(gè)抗病相關(guān)的UniGene在不同組織、病原菌誘導(dǎo)、激素處理和非生物脅迫條件下進(jìn)行表達(dá)特性分析。6個(gè)UniGene已經(jīng)在文庫(kù)篩選過(guò)程中功能注釋分別為VTC2,SAMDC，SHMT,半乳糖結(jié)合凝集素，JIP和LHY蛋白。①組織特異性表達(dá)分析結(jié)果表明，6個(gè)UniGene均能在拔節(jié)期的根、莖、葉及穗，和苗期的根和葉中表達(dá)，其中在穗或

4、根中表達(dá)水平相對(duì)較高；②病原菌誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果表明，6個(gè)UniGene對(duì)條銹菌和白粉菌誘導(dǎo)的應(yīng)答反應(yīng)模式不同。CN19在接種CY32后，6個(gè)UniGene皆能在24-48小時(shí)內(nèi)被誘導(dǎo)表達(dá)，積累到比較高的水平，而白粉病菌浸染后僅有半乳糖結(jié)合凝集素、VTC2和JIP基因在接種48小時(shí)后開(kāi)始表達(dá)，在96小時(shí)達(dá)到高峰。推測(cè)SAMDC、SHMT及LHY基因是小麥條銹菌(CY32)誘導(dǎo)的高豐度表達(dá)基因；③激素誘導(dǎo)表達(dá)分析表明，6個(gè)UniGene皆對(duì)應(yīng)答

5、乙烯(Et)產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，而對(duì)SA和ABA產(chǎn)生不同的應(yīng)答反應(yīng)，推測(cè)CN19與CY32不親和互作反應(yīng)主要通過(guò)Et/JA途徑調(diào)控，SA與ABA對(duì)防御反應(yīng)中的部分基因具有調(diào)控作用；④JIP、植物凝集素基因和SHMT也參與冷、干旱和高鹽非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。
　　 2 TaLHY基因的克隆與生物信息學(xué)分析：從構(gòu)建的SSH-cDNA文庫(kù)中，利用RACE-PCR技術(shù)克隆了一個(gè)小麥MYB轉(zhuǎn)錄因子--TaLHY基因。其cDNA全長(zhǎng)3085bp，

6、其開(kāi)放閱讀框?yàn)?947bp，推測(cè)編碼蛋白為648個(gè)氨基酸，分子量為70.3kDa,等電點(diǎn)為6.34;具有一個(gè)典型的植物MYB-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在結(jié)構(gòu)域的C-端具有十分保守的氨基酸序列SH[AL]QKY[RF]，與其他已公布的LHY家族成員具有較高的序列一致性，首次在小麥中報(bào)道了LHY蛋白，亞細(xì)胞定位分析TaLHY蛋白定位于細(xì)胞核，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。TaLHY基因能在條銹菌誘導(dǎo)48小時(shí)后表達(dá)水平提高，同時(shí)在Et處理

7、1小時(shí)和4小時(shí)表達(dá)水平提高，證明了該基因參與小麥抗條銹病防御反應(yīng)相關(guān)，同時(shí)，該基因參與防御反應(yīng)可能是通過(guò)JA/Et途徑調(diào)控。
　　 3目的基因TaNIT克隆與生物信息學(xué)分析：利用電子克隆結(jié)合RT-PCR技術(shù)，克隆了一個(gè)小麥腈水解酶基因一一TaNIT基因。其cDNA全長(zhǎng)1457bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?023bp，編碼340個(gè)氨基酸，分子量約為36.3kDa，理論等電點(diǎn)pI為5.70;具有典型的NIT家族結(jié)構(gòu)域，和保守的Glu-Lys-