縊蟶堿性磷酸酶基因的克隆及重金屬銅和鋅對其表達的影響.pdf

1、縊蟶是我國四大海水養(yǎng)殖貝類之一,在浙江和福建已有數(shù)百年的養(yǎng)殖歷史。隨著沿海城市經濟的發(fā)展,海洋污染日益加劇,已經嚴重威脅到了縊蟶的生存和生長,因此必須對目前的縊蟶種質資源進行合理的開發(fā)和利用。本研究克隆了縊蟶堿性磷酸酶基因,并研究了其在重金屬銅、鋅脅迫作用下的表達情況。具體研究內容如下:
　　1.縊蟶堿性磷酸酶基因的分子特性及其組織表達分析
　　以縊蟶為材料,根據實驗室構建的縊蟶肝臟cDNA文庫中已標注的EST序列,利用RA

2、CE技術克隆得到了縊蟶ALP基因的cDNA全序列。該序列全長1837 bp,5′端非翻譯區(qū)為130 bp,3′端非翻譯區(qū)為117 bp。開放閱讀框(ORF)長度為1590 bp,可編碼529個氨基酸,含有1個由5個氨基酸組成的信號肽。推測得到的縊蟶縊蟶堿性磷酸酶前體肽具有29個磷酸化位點,與人(Homo sapiens)的堿性磷酸酶3D結構有高度的相似性。同源分析表明,該基因編碼的蛋白與合浦珠母貝(Pinctada fucat)ALP氨

3、基酸序列的相似性最高為48％。系統(tǒng)進化分析表明,縊蟶與合浦珠母貝聚集在一起,但與脊椎動物中的魚類、兩棲類、哺乳動物距離較遠。利用實時熒光定量PCR檢測成體縊蟶的水管、斧足、腮、外套膜、肝臟及性腺6個不同組織中ALP基因的表達情況,結果顯示縊蟶ALP基因在肝臟的表達量最高,其次為外套膜,在水管中的表達量最低。說明,成體縊蟶的堿性磷酸酶具有組織特異性。
　　2. Cu2+、Zn2+脅迫對縊蟶堿性磷酸酶基因表達的影響
　　運用熒光

4、定量PCR技術分析Cu2+、Zn2+在不同劑量以及不同處理時間下對縊蟶不同組織ALP基因表達的影響。實驗結果顯示,Cu2+和Zn2+對縊蟶不同組織ALP基因的表達影響不盡相同:在Cu2+的脅迫下,縊蟶水管、腮、斧足、外套膜ALP基因表達呈現(xiàn)整體下降的趨勢,肝臟中ALP基因的表達呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢,性腺中ALP基因的表達量無明顯變化;在Zn2+的脅迫下,水管、腮、外套膜ALP基因表達呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢,斧足和肝臟中ALP基因的

5、表達呈現(xiàn)整體持續(xù)升高的趨勢,性腺中ALP基因的表達量無明顯變化。實驗結果還顯示,不同濃度Cu2+、Zn2+以及不同處理時間與縊蟶ALP基因表達的存在一定的相關性。
　　3. Cu2+和Zn2+對縊蟶的急性毒性研究
　　用靜態(tài)急性毒性試驗方法,研究了12h、24h、36h、48h、72h和96h內重金屬Cu2+、Zn2+對縊蟶的毒性影響。結果表明:Cu2+對縊蟶的2h、12h、24h、36h、48h、72h和96h的LC50為

6、1.022 mg·L-1、0.623 mg·L-1、0.277 mg·L-1、0.194 mg·L-1、0.073 mg·L-1、0.064 mg·L-1和0.044 mg·L-1;Zn2+對縊蟶的2h、12h、24h、36h、48h、72h和96h的LC50為34.601mg·L-1、26.145mg·L-1、23.563mg·L-1、9,908mg·L-1、6.531mg·L-1、4.127mg·L-1和2.664mg·L-1。經過

7、計算的到Cu2+和Zn2+對縊蟶的安全濃度分別為:0.004 mg·L-1、0.226 mg·L-1,說明Cu2+對縊蟶的毒性遠大于Zn2+。此外,還初步探討了Cu2+和Zn2+對縊蟶的急性毒性效應和致毒機理,且差異顯著。
　　4.縊蟶SRAP-PCR體系的正交優(yōu)化
　　運用L16(45)正交設計對影響縊蟶SRAP-PCR反應的5個因素:Taq酶濃度、Mg2+濃度、模板DNA濃度、dNTPs濃度、引物濃度在4個水平上進行了優(yōu)

8、化試驗，PCR結果采用SPSS v16.0軟件分析。結果表明,各因素對SRAP-PCR反應的影響依次為:引物>Taq酶>DNA模板DNA>Mg2+;縊蟶SRAP反應最佳體系為:在20μL PCR反應體系中,引物0.3μmolL-1、Taq酶0.5 U、模板DNA50 ng、dNTPs0.2 mmolL-1、Mg2+2 mmolL-1。用不同縊蟶的基因組DNA兩次SRAP-PCR擴增,8對引物均能擴增出清晰且重復性好的普帶。因而建立的縊蟶