豬β-防御素基因表達特點及維生素A的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、防御素是抗菌肽家族成員之一，具有廣泛的抗菌、抗病毒、抗寄生蟲和免疫調(diào)節(jié)作用，是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。維生素A作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，對動物的抗感染能力、細胞因子以及相關(guān)基因表達水平的影響十分明顯。然而，關(guān)于豬防御素基因表達規(guī)律及維生素A對其表達的調(diào)節(jié)作用目前尚未見報道。本研究旨在考察豬防御素基因表達的品種和組織差異及維生素A對其表達的影響，以揭示豬防御素基因的表達特點和維生素A的調(diào)節(jié)作用。本試驗首先考察了不同抗病力的兩種豬體內(nèi)防御素-

2、1、2、3基因表達的差異，并通過體外細胞培養(yǎng)試驗比較了不同維生素對防御素-1、2、3基因表達的影響，重點研究了在動物試驗中維生素A對豬防御素-1、2、3基因表達的影響，初步探討了維生素A影響豬防御素-1、2、3基因表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。本研究包括以下四個試驗：
　　 試驗一DLY和梅山仔豬pBD基因表達差異的研究
　　 通過觀察防御素基因在DLY和梅山仔豬各個組織中的表達水平，比較了兩個豬種之間的表達差異。本實驗隨機選擇健

3、康的7日齡梅山豬和DLY（杜×長×大）雜交豬各6頭，公母各半。屠宰后立即取其小腸黏膜、心、肝、脾、肺、腎、腦、皮膚、肌肉、口腔黏膜、呼吸道上皮、舌頭、胸腺、生殖道上皮、睪丸（公）或卵巢（母），提取總RNA，用Real-timePCR方法檢測pBD-1、2、3基因mRNA表達水平。
　　 結(jié)果表明：所有組織中均能檢測出pBD基因mRNA的表達。其中梅山豬中，pBD-1、2、3在舌頭和口腔黏膜的表達量最高；而DLY雜交豬中，pBD-

4、1、3在舌頭和口腔黏膜的表達量最高，pBD-2在腎臟和肝臟的表達量最高。絕大部分組織的pBD基因表達量均為梅山豬高于DLY雜交豬，其中小腸黏膜、舌、口腔黏膜和生殖道黏膜等與外界接觸的組織中的pBD-1、2、3表達量均是以梅山豬為高。由此顯示，豬pBD的表達存在明顯的品種差異和組織特異性，梅山豬體內(nèi)pBD-1、2、3基因在多個組織中的表達量要高于DLY三元雜交豬。
　　 試驗二VA、VD、VE對IPEC-J2細胞系pBD基因mRN

5、A和蛋白質(zhì)表達的影響
　　 為了考察VA、VD、VE對pBD-1、2、3基因mRNA與蛋白質(zhì)表達的影響，本實驗選用豬小腸上皮細胞系IPEC-J2為研究對象，在無血清DMEM/F12培養(yǎng)基上分別添加不同濃度的維生素A、D、E培養(yǎng)，24小時后，提取總RNA和蛋白。用Real-timePCR法測定pBD-1、2、3基因mRNA表達水平，用ELISA方法測定pBD-1、2、3蛋白含量。分析不同濃度維生素對pBD基因與蛋白表達的影響。

6、r>　　 結(jié)果表明：維生素A、D、E均能夠不同程度的誘導(dǎo)豬小腸上皮細胞pBD基因的表達并能促進pBD蛋白的分泌。其中，0.5～20μmol/L維生素A可顯著提高pBD-1、pBD-2和/或pBD-3基因的mRNA表達水平和蛋白質(zhì)表達水平；5～50nmol/L維生素D顯著提高了pBD-1、pBD-2或pBD-3基因的mRNA表達水平或蛋白質(zhì)表達水平；20和50μg/ml維生素E顯著提高了pBD-1和pBD-3基因的mRNA表達水平或蛋白

7、質(zhì)表達水平。結(jié)果提示，在本實驗濃度范圍內(nèi)，維生素A、D、E可以促進pBD-1、2、3基因mRNA與蛋白的表達，其中維生素A對pBD-1、2、3基因表達的促進作用效果較好。
　　 試驗三VA對DLY和榮昌仔豬pBD基因表達的影響
　　 為了考察動物試驗中維生素A對內(nèi)源防御素表達的影響，本試驗選用產(chǎn)期相近、胎次相似、相同環(huán)境飼養(yǎng)健康的21日齡斷奶、體重約3.5-4kg榮昌豬斷奶仔豬24頭，按體重隨機分為4組，1、3組飼喂維生

8、素A缺乏日糧，2、4組飼喂正常水平維生素A日糧。另外選擇產(chǎn)期相近、胎次相似、相同環(huán)境飼養(yǎng)健康的21日齡斷奶、體重6.5-7kgDLY斷奶仔豬30頭，按體重隨機分為5組，5、7組飼喂維生素A缺乏日糧，6、8組飼喂正常水平維生素A日糧，9組飼喂高劑量維生素A（5倍NRC水平）日糧。每個處理組設(shè)有6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬，試驗期包括預(yù)飼兩周和正式試驗四周，在正式試驗第14天對3、4、7、8和9組實驗動物接種PRRS弱毒苗。進行飼養(yǎng)試驗和屠宰試

9、驗。
　　 結(jié)果表明：
　　 1.DLY豬的日增重和日采食量均顯著高于榮昌豬；攻毒（接種PRRS弱毒苗）顯著降低了兩種豬的日增重和日采食量，顯著升高了其料重比；攻毒對DLY豬生產(chǎn)性能的影響強于榮昌豬；
　　 2.DLY豬體內(nèi)血清視黃醇濃度和肝臟視黃醇濃度均顯著高于榮昌豬；攻毒可降低豬血清視黃醇濃度，顯著提高肝臟視黃醇濃度：維生素A缺乏顯著降低了血清視黃醇濃度和肝臟視黃醇濃度；高劑量維生素A顯著升高了肝臟視黃醇濃度

10、，升高血清視黃醇濃度；
　　 3.攻毒顯著提高了豬血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的濃度；維生素A缺乏顯著降低了豬血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的濃度；攻毒對DLY豬血清中IgA和IgG的影響強于榮昌豬；
　　 4.攻毒顯著提高細胞因子IL-1a、IL-1β、IL-10的濃度；維生素A水平缺乏顯著
　　 提高了細胞因子IL-1a、IL-1β的濃度，降低了細胞因子IL-10的濃度；
　　 5.

11、接種PRRS弱毒苗對pBD-1、3基因表達的影響不大，能顯著提高pBD-2在肺、脾、腸系膜淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)中的表達；日糧中維生素A水平對pBD-2基因表達的影響不大，能顯著影響pBD-1、3在舌、口腔黏膜、呼吸道黏膜和小腸黏膜中的表達。
　　 結(jié)果顯示，攻毒降低了試驗動物日采食量、日增重和血清維生素A，提高了豬血清中免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的濃度，提高了pBD-2基因在肺、脾、腸系膜淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)中的表達，相比

12、較而言，攻毒對DLY豬的影響要強于榮昌豬；維生素A缺乏降低了血清視黃醇的含量與體內(nèi)部分組織中pBD-1、3基因的表達，攻毒可以加劇這種作用。
　　 試驗四VA影響pBD基因表達信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究
　　 為初步揭示維生素A誘導(dǎo)pBD-1、2、3基因表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，本試驗以IPEC-J2細胞系為研究模型，考察信號通路阻斷劑對維生素A誘導(dǎo)pBD-1、2、3基因mRNA表達的影響。試驗選用的信號通路阻斷劑有NF-κB通路阻斷

13、劑MG-132和MEK-ERK通路阻斷劑PD98059，采用單因子試驗設(shè)計，共分對照組、維生素A組、MG-132組、PD98059組、維生素A+MG-132組和維生素A+PD98059組6個處理組。
　　 結(jié)果表明，MG-132極顯著的降低了維生素A對pBD-2基因的誘導(dǎo)作用，PD98059極顯著的降低了維生素A對pBD-1和pBD-3基因的誘導(dǎo)作用。結(jié)果提示，NF-κB通路可能是維生素A影響pBD-2基因表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一

14、；MEK-ERK通路可能是維生素A影響pBD-1、3基因的表達的信號通路之一。
　　 綜上所述，本研究結(jié)果表明：
　　 1.抗病力不同的梅山豬和DLY豬體內(nèi)pBD的表達水平也不相同，抗病力較高的地方豬種--梅山豬具有較高的防御素表達量。
　　 2.維生素A、D、E均能夠誘導(dǎo)豬小腸上皮細胞pBD-1、2、3基因的表達，并能促進其蛋白質(zhì)的分泌。其中，維生素A對pBD-1、2、3基因表達的誘導(dǎo)作用最為顯著。