一種新型芥菜基因工程難性不育系的創(chuàng)建.pdf

1、利用雄性不育系則是雜種優(yōu)勢(shì)育種最重要的途徑之一,其中,基因工程雄性不育系的利用被作為最具前景的育種途徑,成為當(dāng)今世界范圍內(nèi)研究、開發(fā)和利用的熱點(diǎn)。而雄性不育新種質(zhì)的創(chuàng)建、保持以及育性恢復(fù)是基因工程雄性不育研究的的核心問題。就基因工程雄性不育的保持來說,目前有兩個(gè)途徑:一是通過組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行保存,該方式技術(shù)性強(qiáng),在大規(guī)模種子生產(chǎn)中應(yīng)用困難;途徑之二是與對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因保持系雜交,但其雜交后代中將產(chǎn)生約50%的可育植株而無法得到純系,制種

2、時(shí)需要田間使用除草劑以及親本種子浪費(fèi)等問題。另外,對(duì)于以采收果實(shí)、種子為栽培目的的農(nóng)作物來說,還需要解決基因工程雄性不育雜種一代的育性恢復(fù)問題。因此,研究和探索基因工程雄性不育系保持以及育性恢復(fù)的新方法和途徑非常必要。
　　 植物雄性不育基因工程研究中,來自于解淀粉芽孢桿菌的RNA酶基因Barnase是最為常用的雄性不育目的基因。目前,利用Barnase雄性不育基因已經(jīng)成功在油菜、菊苣、玉米中獲得了商業(yè)化應(yīng)用的雄性不育系。而針對(duì)

3、Barnase毒蛋白的結(jié)構(gòu)及酶活性研究結(jié)果顯示,該蛋白可以被拆分為不具毒性的N端和C端多肽。而SspDnaE內(nèi)含肽是在Synechocystissp.PCC6803(集胞藻,藍(lán)藻的一種)中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有反式剪接功能的斷裂型內(nèi)含肽,分別由123個(gè)氨基酸的N端肽鏈和36個(gè)氨基酸的C端肽鏈組成,其結(jié)構(gòu)及剪接特點(diǎn)非常適合用于分拆后蛋白質(zhì)N端和C端肽鏈之間的連接,并恢復(fù)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。因此,本論文結(jié)合植物核雄性不育的特點(diǎn),以芥菜為研究對(duì)象,將B

4、arnase基因序列分拆成為36個(gè)氨基酸的N端和75個(gè)氨基酸的C端部分,并分別與SspDnaE內(nèi)含肽N端和C端融合獲得融合基因并置于絨氈層特異啟動(dòng)子A9的調(diào)控下,融合基因分別導(dǎo)入芥菜時(shí)獲得可育轉(zhuǎn)基因植株。而將兩個(gè)融合基因共轉(zhuǎn)化或者獲得的單獨(dú)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行雜交,獲得的共轉(zhuǎn)化植株或者雜交后代植株因兩條融合多肽在絨氈層細(xì)胞中共表達(dá),通過SspDnaE內(nèi)含肽所具有的反式剪接功能,Barnase毒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能在絨氈層細(xì)胞中恢復(fù),獲得了雄性不育。

5、該雄性不育系與其它非轉(zhuǎn)基因植株雜交后,獲得的雜交后代將因N端和C端融合基因分離而育性得到恢復(fù)。獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1、構(gòu)建了系列表達(dá)載體用于芥菜的單獨(dú)轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化,獲得芥菜轉(zhuǎn)基因植株
　　 (1)pCABarBN:大白菜絨氈層特異啟動(dòng)子A9驅(qū)動(dòng)非拆分Barnase毒蛋白基因表達(dá),篩選標(biāo)記基因?yàn)锽ar基因;(2)pCABarBN-N/Int-N:A9啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Barnase毒蛋白基因N端(1-36位氨基酸)與S

6、spDnaEN端(123個(gè)氨基酸)融合基因表達(dá),篩選標(biāo)記基因?yàn)锽ar基因;(3)pCANPTInt-C/BN-C:A9啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)SspDnaEC端(36個(gè)氨基酸)與Barnase毒蛋白C端(37-111位氨基酸)融合基因表達(dá),篩選標(biāo)記基因?yàn)镹PTⅡ基因;(4)pCABarBN-N:A9啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Barnase毒蛋白基因N端(1-36位氨基酸)多肽表達(dá),篩選標(biāo)記基因?yàn)锽ar基因;(5)pCANPTBN-C:A9啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Barnase毒蛋

7、白基因C端(37-111位氨基酸)多肽表達(dá),篩選標(biāo)記基因?yàn)镹PTII基因。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將pCABarBN、pCABarBN-N/Int-N、pCANPTInt-C/BN-C、pCABarBN-N、pCANPTBN-C分別單轉(zhuǎn)化于芥菜;分別將pCABarBN-N/Int-N與pCANPTInt-C/BN-C、pCABarBN-N與pCANPTBN-C、pCABarBN-N/Int-N與pCANPTBN-C共轉(zhuǎn)化于芥菜,獲得轉(zhuǎn)基因芥菜

8、植株。經(jīng)含草丁膦PPT的篩選培養(yǎng)基多次篩選,分別獲得了pCABarBN、pCABarBN-N/Int-N、pCABarBN-N轉(zhuǎn)基因植株;經(jīng)含卡那霉素的篩選培養(yǎng)基多次篩選,分別獲得了pCANPTInt-C/BN-C、pCANPTBN-C轉(zhuǎn)基因植株;經(jīng)含草丁膦和卡那霉素篩選培養(yǎng)基的多次篩選,分別獲得了pCABarBN-N/Int-N與pCANPTInt-C/BN-C、pCABarBN-N與pCANPTBN-C、pCABarBN-N/Int

9、-N與pCANPTBN-C基因共轉(zhuǎn)化植株。
　　 2、轉(zhuǎn)基因芥菜植株的分子檢測(cè)
　　 利用CTAB法提取各轉(zhuǎn)基因植株幼苗DNA,進(jìn)行目的基因的PCR鑒定,結(jié)果顯示所有單轉(zhuǎn)化植株中,相應(yīng)的目的基因已整合到芥菜植株中。而獲得的pCABarBN-N/Int-N與pCANPTInt-C/BN-C、pCABarBN-N與pCANPTBN-C、pCABarBN-N/Int-N與pCANPTBN-C共轉(zhuǎn)化植株均同時(shí)整合入了N端和C端基

10、因。
　　 3、轉(zhuǎn)基因芥菜植株的育性比較
　　 獲得的轉(zhuǎn)基因芥菜植株開花后,對(duì)其雄性不育性進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示上述pCABarBN-N/Int-N、pCANPTInt-C/BN-C、pCABarBN-N、pCANPTBN-C單獨(dú)轉(zhuǎn)化植株以及pCABarBN-N與pCANPTBN-C、pCABarBN-N/Int-N與pCANPTBN-C基因共轉(zhuǎn)化植株均表現(xiàn)為雄性可育,其花瓣鮮黃色、花絲較長、花藥飽滿,花藥成熟開裂后有

11、大量花粉散出;而pCABarBN-N/Int-N與pCANPTInt-C/BN-C基因共轉(zhuǎn)化植株與pCABarBN轉(zhuǎn)基因植株一樣,出現(xiàn)了典型的雄性不育性狀,花瓣淡黃色、花絲較短、花藥瘦小,花粉囊里沒有花粉出現(xiàn)。
　　 4、轉(zhuǎn)基因芥菜植株花粉細(xì)胞發(fā)育分析
　　 利用石蠟切片和顯微觀察技術(shù)對(duì)上述獲得的轉(zhuǎn)基因芥菜可育植株和不育植株的花藥發(fā)育過程進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,可育植株(轉(zhuǎn)pCABarBN-N/Int-N、pCANPTIn

12、t-C/BN-C、pCABarBN-N、pCANPTBN-C以及pCABarBN-N與pCANPTBN-C、pCABarBN-N/Int-N與pCANPTBN-C基因共轉(zhuǎn)化植株)的花藥發(fā)育正常,可發(fā)育為成熟的花粉粒:而pCABarBN-N/Int-N與pCANPTInt-C/BN-C的共轉(zhuǎn)化植株與pCABarBN植株的花粉發(fā)育過程基本一致,花粉絨氈層細(xì)胞提前降解,花藥發(fā)育成熟后無正常花粉粒產(chǎn)生,花藥敗育。
　　 5、轉(zhuǎn)基因芥菜植

13、株的結(jié)子習(xí)性
　　 將上述獲得的轉(zhuǎn)基因植株分別進(jìn)行自交,結(jié)果顯示pCABarBN-N/Int-N、pCANPTInt-C/BN-C、pCABarBN-N、pCANPTBN-C單轉(zhuǎn)化植株以及pCABarBN-N與pCANPTBN-C、pCABarBN-N/Int-N與pCANPTBN-C共轉(zhuǎn)化植株自交后大多數(shù)果莢飽滿,有正常形態(tài)種子形成。而轉(zhuǎn)pCABarBN基因植株自交后花朵早期脫落,不能結(jié)莢,無種子形成;pCABarBN-N/I

14、nt-N與pCANPTInt-C/BN-C共轉(zhuǎn)化植株能夠結(jié)莢,但與可育株相比,果莢短小、空癟,無種子形成。而pCABarBN轉(zhuǎn)基因植株、pCABarBN-N/Int-N與pCANPTInt-C/BN-C共轉(zhuǎn)化植株用來自非轉(zhuǎn)基因植株的花粉授粉后,則均能正常結(jié)莢結(jié)籽。
　　 6、pCABarBN-N/Int-N和pCANPTInt-C/BN-C轉(zhuǎn)基因植株雜交后代育性分析
　　 將獲得的T0代pCABarBN-N/Int-N轉(zhuǎn)