豬脂蛋白脂酶（LPL）和激素敏感脂肪酶（HSL）基因的序列和多態(tài)性分析及體外表達的研究.pdf

1、在現(xiàn)代動物育種實踐中，通過在分子水平上識別控制重要經(jīng)濟性狀的遺傳標記或者基因座，以便在早期或超早期直接對個體進行選擇是一種極為重要的手段，也是為廣大育種工作者廣泛采用的一種方法。這種借助分子標記輔助選擇(MAS)進行豬的遺傳改良、提高豬的生產性能的方式的前提是必須找到盡可能多的合適的遺傳標記信息。 本實驗以脂蛋白脂酶(LPL)和激素敏感脂肪酶(HSL)基因作為豬脂肪代謝相關性狀的侯選基因，主要著眼于發(fā)現(xiàn)新的單核苷酸多態(tài)性(Sin

2、gleNucleotidePolymorphisms，SNPs)位點和有效的分子標記信息。同時也開展了豬LPL和HSL基因的原核和真核的體外表達，為通過基因工程的手段來調控豬脂肪代謝的研究做了初步的探索。主要研究結果如下： 1.通過提取不同品種豬的脂肪組織的RNA、進行RT-PCR，得到不同品種豬的HSL和LPL基因的全長cDNA序列。利用CLUSTALW軟件對豬和從Genbank數(shù)據(jù)庫中所搜尋到的相關動物物種的HSL和LPL基

3、因進行進化樹分析，初步了解基因在不同物種中的親緣關系。 2.根據(jù)已測的LPL基因的外顯子序列擴增并克隆LPL基因內含子3、5，BLAST比對發(fā)現(xiàn)有20處SNPs，選取直接導致限制性酶切位點的SNPs進行多態(tài)性與性狀的關聯(lián)研究。 3.在F2群體中，內含子3的NheI酶切位點的AA、AB、BB三種基因型在皮率、眼肌高性狀上存在顯著性(p＜0.05)和極顯著性(p＜0.01)的差異。均表現(xiàn)為加性效應的作用方式，且達極顯著水平。

4、 4.內含子3中的EcoT22I酶切位點在F2群體中的研究發(fā)現(xiàn)，AA、BB基因型在6-7肋處膘厚、皮厚、骨率性狀上達到顯著性(p＜0.05)和極顯著性(p＜0.01)。均以加性效應作用為主，達到了顯著性水平(P＜0.05)。 5.在F2豬群體中，內含子3中的NcoI酶切位點的AA、AB、BB基因型在胴體性狀的眼肌高、眼肌寬、眼肌面積上均達到顯著性水平(p＜0.05)。眼肌高是以加性效應的方式為主的(p＜0.05)；而眼肌

5、寬、眼肌面積則以顯性效應作用方式為主的(p＜0.05)。在肉質性狀上NcoI酶切位點的三種基因型在pH(LD)、pH(BF)、色值(BF)、肌內脂肪上達到顯著性(p＜0.05)和極顯著性(p＜0.01)水平。是以顯性效應為主的(p＜0.05)。 6.內含子5中的AfaI位點的三種基因型在F2群體胴體性狀的屠宰率和胸腰部膘厚上存在著顯著性差異(p＜0.05)。以加性效應方式為主，但未達顯著性水平。而在AfaI位點的肉質性狀上，三種

6、基因型在pH(LD)、pH(BF)、pH(SC)、WHC以及WLR和MC1性狀上均達到極顯著性水平(p＜0.01)。以加性效應作用為主(p＜0.01)。 7.內含子5的ScaI酶切位點在F2大梅豬群體中只存在AA和AB兩種基因型。 8.HSL、LPL基因在大腸桿菌中的表達根據(jù)我們從豬中克隆的HSL、LPL基因的編碼序列，將其克隆到pET-28a表達載體上，分別構建成原核表達質粒pET-28a-HSL、pET-28a-LP

7、L，使其在E.coliBL21(DE3)中以IPTG誘導表達，經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，LPL獲得較好的表達，而HSL沒有表達。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，LPL表達產物以包涵體的形式存在。從包涵體中提取LPL表達產物，并用比色法檢測酶活性，發(fā)現(xiàn)該酶具有酶活性。 9.HSL、LPL基因在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中的表達我們把從豬中克隆的HSL、LPL基因的編碼序列，克隆到pPIC9K表達載體上，構建成真核表達質粒pPIC