棗縮果病病原和防治研究.pdf

1、本研究從河北省主要棗區(qū)為害最為嚴重的棗縮果病的癥狀、侵染期及發(fā)病期的調(diào)查入手,對癥狀單一的棗縮果病進行了組織內(nèi)歐文氏桿菌的檢測、病原菌的組織分離、病健果實內(nèi)細菌及真菌種群多樣性的PCR-DGGE及分子克隆分析、棗縮果病組織苦味物質(zhì)的分析及棗縮果病的田間防治等,為河北省棗縮果病病原的確定提供理論基礎(chǔ),篩選有效的化學及生物農(nóng)藥,進一步有效防治棗縮果病的危害和發(fā)展。主要研究內(nèi)容如下:
　　 1河北省主要棗區(qū)棗縮果病癥狀、侵染期及發(fā)病期

2、研究
　　 2007-2009年在河北省阜平縣、唐縣、贊皇縣和行唐縣棗區(qū)選擇試驗點進行了棗縮果病的癥狀、侵染期及發(fā)病期的調(diào)查試驗。河北棗區(qū)大面積發(fā)生且為害最為嚴重的棗縮果病的典型癥狀是:受害果多數(shù)先是肩部或少數(shù)胴部出現(xiàn)淡黃色斑,然后逐漸擴大,成為淡黃色不規(guī)則的凹陷病斑,進而病斑處果肉呈土黃色,松軟、萎縮,果柄暗黃色,易提前形成離層,遇雨天、霧天后病果極短時間內(nèi)大量脫落;未脫落的病果后期病斑處微發(fā)黑、皺縮、干瘦,病組織呈海綿狀壞死

3、,維管束變褐、味苦、不堪食用,無經(jīng)濟價值。比較阜平、唐縣和贊皇棗的發(fā)病期發(fā)現(xiàn),調(diào)查地點棗縮果病發(fā)病時間有差異,阜平的初期病果出現(xiàn)在8月20日左右,8月30日至9月中旬,病果率迅速上升;唐縣棗林縮果病發(fā)病期較阜平提前5 d;贊皇大棗在7月中下旬已發(fā)現(xiàn)病果,8月10日病害已呈現(xiàn)中后期癥狀,比阜平大棗的發(fā)病期提前1個月左右。本研究通過套袋試驗證明,棗縮果病病菌在果實上的侵入期為7月中旬至8月上旬。
　　 2棗縮果病果實內(nèi)歐文氏桿菌的分

4、子檢測
　　 通過對河南灰棗、阜平大棗、清苑大棗及唐縣婆棗縮果病棗果病部及健部DNA的提取,利用歐文氏菌的特異性引物SR3F和SR1CR,采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測歐文氏菌是否存在于棗果實內(nèi)。結(jié)果表明,棗病、建果組織內(nèi)都擴增出了特異性的歐文氏桿菌的條帶。
　　 3棗縮果病病原的分離
　　 本文于2006年-2009年對采自河北省阜平馬房溝村棗區(qū)的婆棗、唐縣羊角鄉(xiāng)棗區(qū)的婆棗、贊皇北豪村的贊皇大棗、行唐鰲魚

5、村的婆棗及河南省孟莊鄉(xiāng)灰棗產(chǎn)區(qū)的棗縮果病果實進行了病原菌的分離試驗,并對其進行了形態(tài)學的鑒定和致病性測定。結(jié)果表明,縮果病棗果內(nèi)微生物的分離比率較低,只達14.0％,且分離的菌株大多來自表皮;經(jīng)培養(yǎng)特征和形態(tài)學鑒定,分離比率較高的是交鏈孢菌真菌(Alternaria),莖點霉菌(Phoma)和小穴殼屬(Dothiorella)真菌次之,還有少量的青霉菌、炭疽菌等和其它未鑒定的真菌和3種細菌,且同屬的真菌分離物形態(tài)差較大。分別選擇分離比率

6、較高的交鏈孢菌、莖點霉菌和小穴殼屬的菌株進行柯赫式證病法回接實驗,3種真菌都能使棗果實發(fā)病,發(fā)病癥狀與林間縮果病癥狀相似,但通常出現(xiàn)軟腐病斑。對林間接種后表現(xiàn)癥狀的果實進行再分離,均可分離出3種真菌。
　　 4棗縮果病果實內(nèi)微生物種群多樣性的PCR-DGGE分析
　　 運用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù),以阜平大棗棗縮果病果實病部、阜平大棗健康果實抽提到的組織總DNA為模板,對其細菌16S rDNA的V3可變區(qū)及真菌18S

7、 rDNA進行擴增,并對擴增產(chǎn)物進行DGGE指紋圖譜分析,以研究阜平大棗縮果病果實與健康果實內(nèi)的微生物種群變化。試驗結(jié)果表明,PCR-DGGE法是研究棗果內(nèi)微生物組成的可行方法;阜平大棗縮果病果實內(nèi)細菌及真菌種群較健康果實種類減少,有些細菌優(yōu)勢菌在病部樣品內(nèi)不存在,健部部分優(yōu)勢菌在病部為非優(yōu)勢菌,真菌優(yōu)勢菌群病果較健康果實種類減少。
　　 5棗縮果病果實內(nèi)微生物種群多樣性的分子克隆研究
　　 本文以棗縮果病發(fā)病期采集的病

8、果和健康果實為材料,利用基于PCR技術(shù)的分子生物學方法-16S rRNA基因克隆文庫的構(gòu)建(16S rRNA Gene Clone Library)技術(shù),分析阜平大棗縮果病果實、健康果實和河南灰棗縮果病果實、健康果實內(nèi)的細菌16S rDNA和真菌18S rDNA基因片段多態(tài)性,結(jié)合克隆、測序,研究了棗病果和健康果實內(nèi)的細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的變化。對每個樣品分別隨機挑取的10個經(jīng)檢測后的陽性克隆子進行測序,結(jié)果表明:真菌和細菌分別只在河南灰

9、棗病樣中得到了兩種不同的微生物基因片段。
　　 6棗縮果病組織苦味物質(zhì)的色譜分析
　　 本文利用不同極性溶劑水、乙醇、正己烷-乙酸乙酯-丁醇對不同地區(qū)采集的棗縮果病果實病斑處苦味物質(zhì)進行抽提并對其進行高壓液相色譜和氣-質(zhì)聯(lián)用色譜的分析。結(jié)果表明,溶劑水、乙酸乙酯和丁醇不適于苦味物質(zhì)的提取,乙醇和正己烷可以從病果組織內(nèi)提取出帶有明顯苦味的物質(zhì);5個地區(qū)的病樣提取物經(jīng)高壓液相色譜分析后,都未發(fā)現(xiàn)明顯的可以區(qū)別于對照樣品的峰譜

10、;唐縣婆棗、贊皇大棗、阜平大棗、河南灰棗和行唐婆棗樣品正己烷提取物經(jīng)氣-質(zhì)聯(lián)用色譜儀分析,病樣內(nèi)都出現(xiàn)了不同于健康樣品的物質(zhì),這些病樣內(nèi)的特殊物質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜分析后其化學結(jié)構(gòu)式與所用氣-質(zhì)聯(lián)用色譜儀內(nèi)NIST05.L質(zhì)譜圖庫中相似性高于90％以上的物質(zhì)有Hexadecanenitrile(十六烷基腈)、Oleanitrile(油酸腈)、Hexadecanamidel(十六酰胺)、9-Octadecenamide(9-十八烯酰胺),其相似性分別

11、為91％、95％、96％、95％,其中Oleanitrile和Hexadecanamide的化學結(jié)構(gòu)式含有苦味基團“≡N”。
　　 7棗縮果病防治研究
　　 據(jù)查閱棗縮果病防治資料和作者前期對棗縮果病病原菌的分離結(jié)果,為進一步有效防治棗縮果病的危害和發(fā)展,選用藥劑和粘著劑共12種物質(zhì),組合成9種藥劑配方進行了田間藥劑試驗。結(jié)果表明:0.5％NaHC03+0.25％植物油+洗潔精,高脂膜200倍液+鏈霉素140單位/毫升+