乙烯誘導(dǎo)伏令夏橙果實(shí)脫落過程中重要功能基因的克隆、表達(dá)與功能分析.pdf

1、柑橘果實(shí)發(fā)育過程中若受到過度脅迫會(huì)導(dǎo)致大量落果，從而造成大幅度減產(chǎn)，特別是晚熟品種在越冬時(shí)常會(huì)遇到低溫，導(dǎo)致采前落果，造成巨大損失。另外，目前柑橘的采收方式主要為人工采摘，成本很高，在美國甚至超過柑橘生產(chǎn)成本的總和。因此，能實(shí)現(xiàn)果實(shí)的可控脫落成為柑橘生產(chǎn)者和科研工作者追求的主要目標(biāo)之一。
　　 本研究利用柑橘基因組芯片(Citrus Genome Array)研究乙烯誘導(dǎo)柑橘果實(shí)脫落并探討其分子機(jī)理。研究中使用濃度為20μL/L

2、的乙烯分別處理帶葉的伏令夏橙(Citrussinensiscv.Valencia)果實(shí)4h、12h和24h，然后提取果實(shí)離層RNA進(jìn)行芯片檢測。聚類分析結(jié)果表明，芯片數(shù)據(jù)具有較好的重復(fù)性。12條典型基因的RealTime-PCR分析結(jié)果也表明這些基因表達(dá)的變化趨勢與芯片數(shù)據(jù)基本一致。對乙烯誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)乙烯處理3個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均表達(dá)的基因有510條(P＜0.01)。對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)乙烯誘導(dǎo)下上調(diào)表達(dá)的主要有

3、編碼膜類蛋白、能量代謝相關(guān)蛋白、脅迫相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、絲氨酸/蘇氨酸激酶類、磷酸酶類、鈣離子結(jié)合蛋白類、水解酶類、乙烯代謝途徑相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)移酶類、受體蛋白類等基因，下調(diào)表達(dá)的主要包括編碼核糖體類蛋白、水解酶類、水通道蛋白、細(xì)胞色素P450、金屬離子結(jié)合蛋白、光合系統(tǒng)相關(guān)蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、脂酶類等基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，編碼乙烯代謝途徑相關(guān)蛋白的基因、傷害誘導(dǎo)基因和編碼低氧脅迫蛋白的基因之間存在著關(guān)聯(lián)表達(dá)，因而篩選出ETR2、低氧應(yīng)答

4、基因和傷害誘導(dǎo)基因進(jìn)行深入研究。主要結(jié)果如下：
　　 克隆了乙烯誘導(dǎo)表達(dá)的低氧應(yīng)答基因(CsHRP)并進(jìn)行表達(dá)分析。采用RACE技術(shù)克隆了CsHRP的全長eDNA并測序分析。結(jié)果表明，CsHRP的cDNA全長為795bp，ORF編碼98個(gè)氨基酸。序列比對分析結(jié)果顯示CsHRP與甜橙低氧應(yīng)答基因的同源性達(dá)97％。對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果推測CsHRP可能與抗病有關(guān)。采用Real-timePCR方法檢測了CsHRP在外源乙烯誘導(dǎo)下

5、的表達(dá)情況，結(jié)果顯示CsHRP在乙烯處理前期(4h)高度表達(dá)，12h后減低到原來的水平。
　　 乙烯可誘導(dǎo)傷害誘導(dǎo)蛋白(Woundinduced proteins，WIPs)的表達(dá)。本研究克隆了柑橘的4條傷害誘導(dǎo)基因CsWIP1、CsWIP2、CsWIP3和CsWIP4，序列分析結(jié)果表明這4個(gè)傷害誘導(dǎo)基因分為兩類，其中CsWIP1、CsWIP2和CsWIP3聚為一類，而CsWIP4與前三者在結(jié)構(gòu)上差異較大故聚為另一類。WIP蛋白

6、在C-端有一個(gè)非常保守的α-螺旋，在N-端也有一個(gè)α-螺旋，CsWIP1、CsWIP2和CsWIP3在兩個(gè)α-螺旋處都保守，而CsWIP4只在C-端α-螺旋處保守。Real-timePCR結(jié)果顯示：CsWIP1僅在外源乙烯處理下表達(dá)，受乙烯誘導(dǎo)；CsWIP2無論是在傷害處理還是在乙烯處理?xiàng)l件下，僅在葉片中表達(dá)，說明CsWIP2的表達(dá)具有組織特異性；CsWIP3在乙烯或傷害處理的葉片和離層中均表達(dá)，說明CsWIP3的表達(dá)沒有組織特異性；C

7、sWIP4僅在傷害處理下表達(dá)，基本上不受乙烯調(diào)控。
　　 ETR2是乙烯受體基因之一。為深入了解乙烯受體基因(ETR2)在伏令夏橙果實(shí)脫落過程中的作用，本研究克隆了ETR2基因并研究了其表達(dá)。通過RACE技術(shù)得到ETR2的cDNA序列為1800bp。序列比對分析表明伏令夏橙ETR2與其它甜橙ETR2的同源性達(dá)98％。ETR2蛋白質(zhì)包含了3個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為GAF結(jié)構(gòu)域、組氨酸蛋白激酶(HPK)同源二聚體結(jié)合區(qū)域和類似CheY結(jié)構(gòu)域