基于Rrop18-rSAG2犬弓形蟲ELISA檢測技術(shù)及藥物篩選研究.pdf

1、弓形蟲病是一種全球分布且危害嚴(yán)重的人畜共患病,人和幾乎所有的溫血動物均能感染弓形蟲,成年人多為隱性感染,孕婦感染后可導(dǎo)致流產(chǎn)、弱胎或死胎。此外,該病也嚴(yán)重危害受孕家畜的生產(chǎn),給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此,建立一套科學(xué)的診斷方法和有效的治療措施至關(guān)重要。
　　 弓形蟲表面蛋白(SAG1和SAG2)和棒狀蛋白被認(rèn)為是弓形蟲病診斷和疫苗研究具有極大優(yōu)勢的兩種候選分子。ROP18是弓形蟲在速殖子、緩殖子都表達(dá)的蛋白,具有激酶活性的絲

2、氨酸-蘇氨酸激酶,并有免疫原性,關(guān)于其研究,目前國內(nèi)外報(bào)道極少。本研究根據(jù)已知基因序列設(shè)計(jì)引物,以提取弓形蟲RH株的總DNA為模板,通過PCR技術(shù)擴(kuò)增rop18的主要基因,將截?cái)嗟膔op18基因連接到原核表達(dá)載體pET32a(+),構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+)-rop18,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),融合蛋白以包涵體形式表達(dá),復(fù)性后表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)western-blot分析,對慢性感染的血清有良好的免疫反應(yīng)原性,利用重組蛋

3、白rSAG2和rROP18,初步建立檢測犬弓形蟲病ELISA檢測方法,對弓形蟲不同時(shí)期(急性、慢性)血清中抗體均能檢出,對72份犬血清進(jìn)行檢測,結(jié)果陽性率為12.5％,與IHA陽性符合率為85.7％,陰性符合率為95.4％。
　　 目前弓形蟲病的防治還依賴于藥物,由于抗弓形蟲公認(rèn)有效的治療藥物的用藥時(shí)間長,毒副作用較大,加上缺乏動物專用抗弓形蟲藥物,因此需要尋找一種高效、低毒專用于動物的抗弓形蟲藥物迫在眉睫,中藥不但具有低毒性、

4、低殘留的優(yōu)點(diǎn),還可以提高動物機(jī)體免疫力和降熱等療效。為此,本研究試圖篩選抗弓形蟲病的中西藥,利用西藥快速有效的作用,結(jié)合中藥清熱、調(diào)節(jié)機(jī)體、低毒副的作用共同進(jìn)行弓形蟲病的治療。
　　 采用體外試驗(yàn),培養(yǎng)Ana-1細(xì)胞作為弓形蟲宿主細(xì)胞,采用MTT法測定藥物對細(xì)胞的安全濃度,將弓形蟲RH株速殖子與Ana-1細(xì)胞在含不同濃度藥物的細(xì)胞培養(yǎng)液中共同培養(yǎng),在加藥后4,8,12,24,48小時(shí),觀察細(xì)胞和弓形蟲生長狀態(tài)和形態(tài),選取48小時(shí)

5、觀察藥物體外抑制蟲體增殖的效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)磺胺氯丙嗪鈉比磺胺嘧啶鈉有更好抑制效果,甘草、百部和黃芩的可顯著抑制弓形蟲增殖。對擬用于抗弓形蟲組方的藥經(jīng)KM小鼠體內(nèi)抗弓形蟲效果的驗(yàn)證,結(jié)果表明甘草、黃芩能夠明顯延長小鼠的存活時(shí)間,磺胺氯丙嗪鈉能使50％的弓形蟲小鼠存活,該藥配伍黃芩和甘草兩種中藥形成復(fù)方藥物,小鼠體內(nèi)抗弓形蟲試驗(yàn)結(jié)果提示中西藥復(fù)方制劑能在保持療效的基礎(chǔ)上減少西藥用量。
　　 抗弓形蟲藥物組方磺胺氯丙嗪鈉聯(lián)合黃芩和甘草在