抗甜瓜枯病生防菌及其生物有機肥的生防機理研究.pdf

1、甜瓜是世界十大水果之一，廣泛種植于溫帶和熱帶地區(qū)，中國甜瓜種植面積和產(chǎn)量分別占世界的48.5％和56.3%。甜瓜枯萎病是一種維管束病害，由甜瓜?；涂菸【怄哏牭兑穑‵usarium oxysporumf sp melonis）引起，在甜瓜全生育期均可發(fā)生。近20年來，隨著保護地栽培方式大范圍推廣，連作甜瓜枯萎病發(fā)生更趨嚴重，甜瓜枯萎病的防治是一種世界性的難題，傳統(tǒng)的化學及農(nóng)業(yè)防治措施通常會帶來環(huán)境問題或成本高、勞動強度大等不能成功的

2、應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)．目前，對于生物防治甜瓜枯萎病雖有報道，但僅局限于生防效果方面，對機理方面研究甚少，另外，可供商品化開發(fā)應用的生防產(chǎn)品并不多。
　　 本論文在分離獲得5株對甜瓜枯萎病原茵具有高效拮抗作用細菌的基礎(chǔ)上，研制出一種抗甜瓜枯萎病的專用生物有機肥，通過盆栽、大田及室內(nèi)試驗研究了其生防效果與機理，采用綠色熒光蛋白標記技術(shù)對生防菌株枯草芽孢桿菌Y-IVI進行了標記，并通過盆栽及室內(nèi)檢測試驗研究了其對甜瓜生長的促生作用及在根際土

3、壤及植株體內(nèi)的定殖情況。
　　 主要結(jié)果如下：
　　 1．甜瓜枯萎病致病菌的分離是生物防治此病害的前提工作．從安徽和縣采集甜瓜枯萎病發(fā)病植株，用尖孢鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基分離獲得致病菌。通過菌落形態(tài)及大、小型分生孢子，厚垣孢子顯微觀察結(jié)果表明分離到的菌株為尖孢鐮刀菌。根據(jù)柯赫法則用孢子懸液接種甜瓜幼苗20d后，枯萎病發(fā)病率達到80%．因此，可以確定分離得到的尖孢鐮刀菌為甜瓜枯萎病致病菌．以其為靶標菌株，利用平板對峙法從健康甜

4、瓜植株根際土壤中初篩獲得對枯萎病病原菌有顯著拮抗作用的5株細菌(Y-6，Y-8，Y-1O，Y-12，Y-IVI)及2株真菌(A1，PI)。5株拮抗細菌發(fā)酵液對甜瓜種子萌發(fā)均無抑制作用。與對照相比，經(jīng)菌株Y-1O，Y-IVI處理的甜瓜種子發(fā)芽率分別提高了10%和5%，胚根長度顯著高于其余3株拮抗細菌發(fā)酵液的處理。拮抗菌株發(fā)酵液對病原菌的生長均有顯著的抑制作用，菌株Y-6、Y-8、Y-1O、Y-12和Y-IVI發(fā)酵液濃度為10%時對病原菌的

5、抑制率分別為54%、67%、75.3%、68%和72.4%，表明菌株Y-10，Y-IVI抑菌效果強于其它菌株。室內(nèi)檢測結(jié)果表明菌株Y-IVI可產(chǎn)生鐵載體、吲哚乙酸和氨等促生類物質(zhì)。經(jīng)生理生化及16S rDNA分子鑒定，確定Y-1O，Y-IVI分別為多粘類芽孢桿菌（Genbank accession number GQ849013）和枯草芽孢桿菌(Genbank accession numberGQ475486)．
　　 2．通過

6、盆栽試驗研究了堆肥和拮抗菌株Y-IVI、Y-10、A1和P1固體二次發(fā)酵生產(chǎn)的生物有機肥對甜瓜枯萎病的生防效果。結(jié)果表明：施用生物有機肥降低了枯萎病發(fā)病率并提高了植株生物量，營養(yǎng)缽育苗和盆缽移栽時均施用生物有機肥的處理甜瓜枯萎病發(fā)病率為20%，而對照的發(fā)病率為80%；施用生物有機肥顯著降低了甜瓜植株莖和根系中病原菌的數(shù)量，營養(yǎng)體育苗和盆缽移栽時均施用生物有機肥II的處理甜瓜植株莖和根系中病原茵的數(shù)量分別為2.27×103和6.67×10

7、3CFU g-1FW，而對照植株莖和根系病原菌數(shù)量分別為8.17×104和3.67×104 CFU g-1FW，病原菌分別降低了97%和82%；施用生物有機肥改變了土壤微生物區(qū)系，根際土壤中細菌、放線菌數(shù)量與對照相比顯著增加，而真菌和病原菌數(shù)量大大減少；營養(yǎng)體育苗和盆缽移栽時均施用生物有機肥的甜瓜植株葉片中與抗病相關(guān)的酶活性低于對照?？傊?，營養(yǎng)缽育苗和大田移栽時均施用生物有機肥可顯著降低甜瓜枯萎病發(fā)病率，提高產(chǎn)量并改善土壤微生物區(qū)系．之

8、后，用綠色熒光蛋白標記Y-IVI(GY-IVI)研究了其對甜瓜生長的促生作用及其在甜瓜植株體內(nèi)及根際土壤中定殖的情況，結(jié)果表明：種子和土壤均經(jīng)過標記菌株GY-IVI處理(GY-IVIs+GY-IVIp)的甜瓜植株地上部、根系干重等顯著高于對照；接種30d后處理GY-WIs+GY-IVIp根際土壤中標記菌株GY-IVI仍維持在108 CFUg-1DW，與接種時的濃度相比并無顯著性變化，而甜瓜植株莖及根系內(nèi)部標記菌株GY-IVI的含量分別為

9、106和107 CFU g-1DW，在對照處理的根際及植株體內(nèi)均未檢測到標記菌株，綜上所述，菌株GY-IVI能促進甜瓜植株的生長并能夠穩(wěn)定的定殖在根際土壤和植株內(nèi)部而對植物產(chǎn)生促生作用。
　　 3．室內(nèi)試驗結(jié)果表明：拮抗菌株B.subtilis Y-IVI發(fā)酵液稀釋10倍后對病原菌仍具有拮抗作用；發(fā)酵液中產(chǎn)生的抗真菌活性物質(zhì)耐酸，耐熱，在pH2處理24 h或80℃水浴2h后仍有拮抗作用，并且對胃蛋白酶和蛋白酶K穩(wěn)定。用HC1沉淀

10、法從發(fā)酵液中提取出脂肽類粗提物，此粗提物對多種病原真菌具有抑制作用。用高效液相色譜反復純化粗提物，最終收集到2個對病原真菌具有較強抑制作用的色譜峰。通過串聯(lián)質(zhì)譜儀測定其分子量分別為1028.7、1042.7、1056.7和1463、1477、1491Da，這兩組物質(zhì)分別屬于伊枯草菌素A和芬枯草菌素．菌株Y-IVI在Landy培養(yǎng)基中產(chǎn)伊枯草菌素最高濃度為89.75 mgL-1．
　　 4．通過盆栽試驗研究了菌株Y-IVI制成的生

11、物有機肥(BIO)對甜瓜枯萎病的防效及其生防機理。結(jié)果表明，營養(yǎng)缽育苗和盆缽移栽時均施用BIO的處理與對照相比，甜瓜枯萎病發(fā)病率降低了9l‰干重增加了3倍。施用BIO能顯著降低病原菌在植株莖、根際土及非根際土中的數(shù)量，而且拮抗菌株Y-IVI能成功定殖在甜瓜植株莖及根際土壤中，移栽10-60 d內(nèi)拮抗菌株Y-WI在根際土壤中的數(shù)量維持在107 CFU－1土。營養(yǎng)缽育苗施用BIO的甜瓜根際土壤中抗菌脂肽類物質(zhì)iturinA的含量為78ug.

12、g'1FW。移栽10d時施用BIO的甜瓜植株葉片中水楊酸含量為17.5ug'g-1FW，顯著高于對照。綜上所述，施用BIO能有效地防治甜瓜枯萎病，其主要機制是拮抗菌株Y-IVI能成功的定殖在甜瓜植株體內(nèi)及根際土壤中，防止病原菌的入侵，且能在甜瓜植株根際產(chǎn)生抗病原真菌的活性物質(zhì)iturin A以抑制病原菌生長繁殖。此外，Y-IVI能誘導甜瓜產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。我們首次從植物－土壤一生防菌－病原菌相互作用的根際土壤中成功檢測并定量了抗菌脂肽類物質(zhì)