紅笛鯛非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞活性及其受體表達(dá)的研究.pdf

1、本論文以我國南方主要海水養(yǎng)殖魚類之一——紅笛鯛(Lutjanus sanguineus)為研究對象，制備了兔抗紅笛鯛非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(NCC)受體NCCRP-1融合蛋白的抗血清，初步建立了NCC的有效分離手段，探討了NCC的活性以及抗血清對NCC活性的抑制作用，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體PGBKT7-NCCRP，研究了NCCRP-1的基因表達(dá)。
　　將表達(dá)的NCCRP-1融合蛋白進(jìn)行純化并利用純化后的融合蛋白按常規(guī)方法免疫新西蘭純

2、種大白兔，制備了兔抗紅笛鯛NCCRP-1融合蛋白的抗血清，ELISA測定其效價為1:32000。利用該抗血清進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)NCCRP-1只在頭腎、脾臟和胸腺的特定細(xì)胞中表達(dá)。
　　為深入研究NCCRP-1抗血清對紅笛鯛NCC活性的抑制作用，首先分離紅笛鯛頭腎中的NCC，選用NCC特異性的作用對象之一——人類細(xì)胞系K562為靶細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測了NCC殺傷K562的活性；并在效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞中加入一定量的兔抗紅笛鯛

3、NCCRP-1融合蛋白抗血清，分析了抗血清對NCC活性的抑制作用。結(jié)果表明，用48％的Percoll細(xì)胞分離液，在400×g，30min的條件下分離出來的NCC效果最佳，流式細(xì)胞儀檢測NCC占整個白細(xì)胞的比例約為(44.8±0.8)％。當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞NCC和靶細(xì)胞K562以一定的比例混合后，流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)NCC具有很強的殺細(xì)胞活性，且這個活性并不隨著兩種細(xì)胞的比例變化而變化；當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比例為1:1并加入不同體積倍比稀釋的抗血清時

4、，所制備的兔抗紅笛鯛NCCRP-1融合蛋白抗血清可抑制NCC的活性，其抑制率隨著抗血清體積的變化而變化。
　　利用PGBKT7質(zhì)粒，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體PGBKT7-NCCRP，為進(jìn)一步研究NCCRP-1蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。
　　應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)，研究脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激紅笛鯛后NCCRP-1在不同組織里的表達(dá)水平差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS刺激紅笛鯛24h后NCCRP-1

5、在紅笛鯛頭腎、脾臟、胸腺、肝臟、心臟、腦、肌肉和腸組織中均有表達(dá)，其中頭腎表達(dá)量最高，脾臟次之，然后依次是肝臟、腦、肌肉、胸腺和腸，心臟表達(dá)量最少。LPS、苯酚和CuSO4刺激紅笛鯛后，隨著刺激時間的增長，NCCRP-1表達(dá)量在各組織達(dá)到峰值的時間不同。以頭腎為模式組織，RT-PCR的結(jié)果顯示，紅笛鯛NCCRP-1在LPS、苯酚和CuSO4的刺激下的表達(dá)模式相似，隨著時間的增加NCCRP-1表達(dá)量逐漸增加，分別在24h、9h和12h處達(dá)