基于Rpf污水處理生物反應(yīng)器中VBNC菌的分離與系統(tǒng)學(xué)研究.pdf

1、利用傳統(tǒng)的常規(guī)培養(yǎng)法從自然界中只能分離到0.01-10％的可培養(yǎng)微生物，絕大部分微生物都處在活的但非可培養(yǎng)(viable but non-culturable，VBNC)狀態(tài)，這種微生物的細(xì)胞仍具有代謝活性，在一定條件的刺激誘導(dǎo)下，能恢復(fù)活性進(jìn)行代謝繁殖，近年來對(duì)于VBNC菌的研究也逐漸受到越來越多的重視。本研究為了探明廢水生物反應(yīng)器中VBNC細(xì)菌及其主要菌種的組成與系統(tǒng)關(guān)系。利用土質(zhì)濾材構(gòu)建生物反應(yīng)器，基于復(fù)蘇促進(jìn)因子(resusci

2、tation promoting factor，Rpf)對(duì)VBNC細(xì)菌的復(fù)蘇刺激生長作用，采用MPN(most probable number)法及其MPN培養(yǎng)系判斷樣品中的細(xì)菌總數(shù)，稀釋平板法分離其中復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC菌株，解析16S rRNA基因系統(tǒng)關(guān)系，采用PCR-DGGE技術(shù)驗(yàn)證Rpf的作用效果及生物反應(yīng)器中VBNC菌的存在。主要結(jié)果如下:
　　1.印染廢水MPN培養(yǎng)系中，處理組MPN值對(duì)應(yīng)的細(xì)菌總數(shù)為9.3×106

3、cell/g-2.4×108 cell/g，大于對(duì)照組MPN值對(duì)應(yīng)的細(xì)菌總數(shù)4.3×106 cell/g-9.3×106 cell/g，表明添加Rpf后可培養(yǎng)化細(xì)菌總數(shù)最高從每g樣品的7.5×106 cell/g提高到2.4×108cell/g; Rpf效果值VR為2.2-32，證實(shí)了印染廢水生物反應(yīng)器中存在對(duì)Rpf敏感、復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC優(yōu)勢(shì)菌群;MPN培養(yǎng)系中處理組各稀釋段培養(yǎng)液的OD660值大于對(duì)照組的OD660值，表明Rpf

4、對(duì)部分細(xì)菌菌種有生長刺激作用;經(jīng)16SrRNA基因測(cè)序及其系統(tǒng)關(guān)系解析，顯示印染廢水中對(duì)Rpf敏感的VBNC優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要有Gordonia、Staphylococcus、Tepidimonas、Ochrobactrum、Moraxella、Enhydrobacter和Cupriavidus屬近緣的菌種，Rpf對(duì)Bacillus、Stenotrophomonas和Lysinibacillus屬菌種有生長刺激作用。系統(tǒng)中所分離細(xì)菌的16S

5、rRNA基因序列與已知近緣典型菌的相似性為96.6-100％，從系統(tǒng)樹上初步判斷其中菌株YDWLR2，YDWLR6和YRJ6可能是新菌種。
　　2.制藥廢水MPN培養(yǎng)系中，處理組MPN值對(duì)應(yīng)的細(xì)菌總數(shù)為2.4×107 cell/g-2.4×108 cell/g，大于對(duì)照組MPN值對(duì)應(yīng)的細(xì)菌總數(shù)1.5×106 cell/g-1.1×108 cell/g，表明添加Rpf后可培養(yǎng)化細(xì)菌總數(shù)最高從每g樣品的4.3×106 cell/g提高

6、到2.4×108cell/g; Rpf效果值VR為2.2-55.8，證實(shí)了制藥廢水生物反應(yīng)器中存在對(duì)Rpf敏感、復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC優(yōu)勢(shì)菌群;同時(shí)MPN培養(yǎng)系中處理組各稀釋段培養(yǎng)液的OD660值均大于對(duì)照組的OD660值，表明Rpf對(duì)部分細(xì)菌有生長刺激作用;經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序及其系統(tǒng)關(guān)系解析，顯示制藥廢水中對(duì)Rpf敏感的VBNC優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要有Candidimonas, Microbacterium， Gordonia, Xan

7、thobacter,Aminobacter和Leucobacter屬近緣的菌種，Rpf對(duì)Comamonas, Alcaligenes和Acidovorax屬近緣菌種有生長刺激作用。系統(tǒng)中所分離細(xì)菌的16S rRNA基因序列與已知近緣典型菌的相似性為96.6-100％，從系統(tǒng)樹上初步判斷其中菌株ZYM1，ZYM3，ZYZR4和ZYXR1可能是新菌種。
　　3.以印染廢水運(yùn)行366d所采樣構(gòu)建的MPN系統(tǒng)為樣品進(jìn)行DGGE電泳，在DG

8、GE圖譜中，處理組的條帶數(shù)明顯多于對(duì)照組的條帶數(shù)，處理組的Shannon-Weaver指數(shù)也明顯高于對(duì)照組，說明處理組相比較于對(duì)照組，處理組中的菌種多樣性更高，證明了Rpf能夠促進(jìn)Rpf敏感菌的生長。通過對(duì)DGGE優(yōu)勢(shì)條帶的測(cè)序，結(jié)合實(shí)際分離菌種的分析后，證實(shí)了菌株YRJ1和YRJ6是由于Rpf的誘導(dǎo)作用，從VBNC狀態(tài)恢復(fù)到可培養(yǎng)狀態(tài)，是存在于印染廢水生物反應(yīng)器中的VBNC菌。
　　本研究利用復(fù)蘇促進(jìn)因子Rpf，探明了廢水生物反