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文檔簡介
1、<p><b> 1前言</b></p><p> 維生素c(vitaminC,以下簡稱Vc)又名L- 抗壞血酸(L- ascorbicacid),是一種人體必需的水溶性維生素。Vc廣泛存在于生物組織中,在新鮮水果、蔬菜和動物肝臟等中的含量尤為豐富。綠色植物能夠自己合成Vc,而人和許多動物由于肝臟中缺少一種古洛內(nèi)酯氧化酶,因而不能自己合成,必須從外界攝取。</p>
2、<p> 1.1 維生素C的理化性質(zhì)</p><p> 1.1.1 維生素C的結(jié)構(gòu)</p><p> 維生素C(Vitamin C),簡稱VC,又名抗壞血酸(Ascobicacid);分子式:C6H8O6,分子量176,結(jié)構(gòu)式見圖1。</p><p> 圖1 維生素c結(jié)構(gòu)式</p><p> 1.1.2 維生素c的物
3、理性質(zhì)</p><p> 維生素c純品為白色單斜晶系的結(jié)晶或結(jié)晶性粉末,無臭味酸,久置色漸微黃。易溶于水,略溶于乙醇,不溶于乙醚、氯仿。它是一種不飽和的多羥基六碳化合物,以內(nèi)酯形式存在,在2,3位碳原子之間烯醇式羥基上的氫可游離出來,故具有酸性。維生素C具有很強(qiáng)的還原性,故極不穩(wěn)定,容易為熱或氧化劑所氧化,在中性或堿性溶液中尤甚;光、微量重金屬(特別是F2+、Cu2+)或熒光物質(zhì)(如核黃素)更能促進(jìn)其被氧化。微
4、量金屬元素對維生素C的氧化分解的催化作用,以銅離子為甚,其順序?yàn)镃u2+>Co2+>Mn2+>Zn2+>Fe2+。在低于pH5.5的溶液中,維生素C較為穩(wěn)定;所以提取維生素C時(shí),草酸和偏磷酸是較好的穩(wěn)定劑。</p><p> 1.2 維生素c的來源</p><p> 維生素C 是簡單結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物,與單糖有密切關(guān)系。研究表明植物中含有抗壞血酸氧化酶,能催化維生
5、素C 氧化[1],維生素C 廣泛分布在植物組織中,新鮮水果及蔬菜中含量尤多。多數(shù)哺乳類和禽類也都能由葡萄糖合成足夠數(shù)量的 L-抗壞血酸。但人、豚鼠、猴子、蝙蝠、某些爬行動物及大多數(shù)人工養(yǎng)殖的魚類甲殼類體內(nèi)缺乏古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶, 不能將古洛糖酸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成L-抗壞血酸,不能生物合成維生素C, 動物體內(nèi)貯藏維生素C 量不大,它們必須經(jīng)常從環(huán)境或食物中攝取維生素C 補(bǔ)充[2]。維生素C 廣泛存在于新鮮水果及綠葉蔬菜中,尤以獼猴桃、板栗(生)、
6、草莓、橘子、刺梨及辣椒等含量豐富。中草藥如醋柳果、蒼耳子等也含有很多維生素C。</p><p> 1.3 人體對維生素c的代謝</p><p> 食物中的維生素C 可通過簡單擴(kuò)散或主動轉(zhuǎn)運(yùn)迅速自胃腸道吸收。維生素C的吸收率隨攝入量增加而相對減少,如攝入100mg 以下幾乎100%吸收,若攝入200mg 僅吸收70%。現(xiàn)在醫(yī)學(xué)及營養(yǎng)保健專家主張小量多次的服用各種維生素C含片, 研究成果表
7、明每日可以達(dá)到500---1000mg 而無任何毒副作用。水楊酸類藥物可抑制維生素C 在胃腸道的吸收,增加維生素C 的排泄,長期服用此類藥物應(yīng)注意維生素C 的補(bǔ)充;而生物類黃酮、鈣和鎂同時(shí)作用,可使維生素C 發(fā)揮最大功效。</p><p> 與其它眾多的水溶性維生素不同,有少量維生素C 貯藏在體內(nèi), 人幾周內(nèi)不攝入維生素C 也不會出現(xiàn)壞血病癥狀。健康成人每100 毫升血漿含0.6 毫克抗壞血酸表明組織飽和,相當(dāng)
8、于體內(nèi)貯存了1500 毫克。吸收后的維生素C 廣泛分布于人體,其在各部的濃度大致與組織的代謝活動相平行,沒有明顯的儲存,以腎上腺和腦垂體中維生素C 含量最高,肝、腎組織,脂肪組織內(nèi)含量最少。維生素C 在組織中以抗壞血酸和脫氧抗壞血酸兩種形式存在,但前者含量遠(yuǎn)高于后者,人血漿中為15∶1。維生素C 在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物主要為CO2和草酸,草酸隨尿排出體外。</p><p> 1.4 維生素c的功用</p>
9、<p> 1.4.1 維生素c的生理功用</p><p> 維生素C有D型和L型兩異構(gòu)體,只有L型具有生理功能,維生素C的生理功能是多方面的:維生素C廣泛存在于植物和某些動物體內(nèi),但人體內(nèi)缺乏古龍酸內(nèi)酯氧化酶,因此人類自身不能合成維生素C,必須靠食物攝入,如長期缺乏人體將患上壞血病。歷史上,壞血病曾是造成人類死亡的嚴(yán)重疾病,長期危害人類健康。維生素C具有抗壞血病活性、是治療壞血病的有效藥物,因此
10、也被人們稱為抗壞血酸。</p><p> 1.4.2 維生素c的主要功能與應(yīng)用</p><p> 維生素C 具有一系列的生理功能,在歷史上曾有“萬能維生素”之譽(yù),事實(shí)上雖然有些言過其實(shí),但在一定程度上反映了維生素C 于人體健康方面的重要性。兩屆諾貝爾獎獲得者,美國著名化學(xué)家林納斯?鮑林(Pauling)曾經(jīng)在“維生素與感冒”一書中,羅列了維生素C 的20 多種功能。概括而言,維生素C
11、的生理功能主要體現(xiàn)在以下10 個方面。</p><p> (1) 增強(qiáng)人體免疫功能</p><p> 維生索C可促進(jìn)入體內(nèi)抗體的形成,提高白細(xì)胞的吞噬能力,提高人體對疾病的抵抗力和對寒冷的耐受力,從而增強(qiáng)人體的免疫功能。</p><p> (2) 預(yù)防和治療缺鐵性貧血</p><p> 食物中鐵存在的離子形式包括Fe2+ 和Fe3+2
12、 種,人體能夠吸收的只有 Fe2+。鐵是合成血紅細(xì)胞的重要材料,人體缺鐵可患缺鐵性貧血癥(IDA),又稱營養(yǎng)性貧血。維生素C具有較強(qiáng)的還原性,可將食物中的Fe3+還原成Fe2+,促進(jìn)食物鐵在腸道內(nèi)的吸收,有利于預(yù)防和治療缺鐵性貧血(IDA)。</p><p> (3) 預(yù)防和治療惡性貧血</p><p> 人體缺乏葉酸(VB11)時(shí)可患惡性貧血(巨幼紅細(xì)胞性貧血)。葉酸對氧較為敏感,而
13、維生素C具有較強(qiáng)的還原性(抗氧化性),一方面,維生素C的存在對葉酸具有保護(hù)功效,可以減少葉酸在烹調(diào)加工過程中的損失,提高膳食中葉酸的有效供應(yīng)量;另一方面,維生素C可將葉酸(F)還原成具有生物活性的四氫葉酸(FH4),促進(jìn)葉酸的活化。維生素C對葉酸可發(fā)揮保護(hù)及活化等雙重作用,從而有利于預(yù)防和治療惡性貧血(巨幼紅細(xì)胞性貧血)。</p><p> (4) 預(yù)防和治療壞血病</p><p>
14、人體輕度缺乏維生素C時(shí),早期癥狀表現(xiàn)為感覺疲勞、牙齦出血等,嚴(yán)重缺乏維生素C 時(shí),則可導(dǎo)致壞血病。保證膳食中維生素C 的足量供應(yīng),有利于預(yù)防和治療壞血病。</p><p> (5) 促進(jìn)膠原的形成和類固醇的代謝</p><p> 一方面,膠原是含有大量羥脯氨酸和羥賴氨酸的纖維狀蛋白質(zhì),它們分別是由脯氨酸和賴氨酸羥基化所形成的。維生素C的作用在于活化脯氨酸羥化酶和賴氨酸羥化酶,促進(jìn)脯氨酸
15、和賴氨酸向羥脯氨酸和羥賴氨酸的轉(zhuǎn)化[3],進(jìn)而促進(jìn)組織細(xì)胞間質(zhì)中膠原的形成。另一方面,維生索C 可參與類固醇的羥基化反應(yīng),如促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸、皮質(zhì)激素及性激素等。</p><p> (6)有利于維持骨骼和牙齒的正常功能</p><p> 維生索C是一種酸性化合物,可在消化道中形成酸性介質(zhì),能防止不溶性鈣絡(luò)合物的生成,促進(jìn)膳食鈣的吸收;維生素C還可進(jìn)一步促進(jìn)鈣在骨骼和牙齒中的沉積,
16、有利于維持骨骼和牙齒的正常功能。</p><p> (7)有利于維持細(xì)胞膜的完整性</p><p> 人體內(nèi)的不飽和脂肪酸(UFA)易被氧化而生成脂性過氧化物,可使各種細(xì)胞膜破裂。還原性谷胱甘肽(G-SH)可使脂性過氧化物還原成羥基化合物,自身轉(zhuǎn)變成氧化型谷胱甘肽(GS-SG),從而消除脂性過氧化物對細(xì)胞膜的破壞作用。維生素C 具有較強(qiáng)的還原性(抗氧化性),在谷胱甘肽還原酶的作用下,可
17、使GS-SG還原為G - S H[3 ]。</p><p> (8) 對某些有毒物質(zhì)具有解毒作用</p><p> 鉛化物、砷化物、苯、細(xì)菌毒素等是日常膳食中常見的有毒有害物質(zhì),對人體健康存在潛在危害。當(dāng)致毒劑量的鉛化物、砷化物、苯以及細(xì)菌毒素等進(jìn)入人體內(nèi)時(shí),充足的維生素C 有利于緩解其毒性[2],從而降低這些有害物質(zhì)對人體健康的危害程度。</p><p>
18、(9) 具有抗衰老作用</p><p> 科學(xué)實(shí)驗(yàn)證明,自由基和過氧化脂質(zhì)是人體衰老的重要誘因。充足的維生素 C 可抑制體內(nèi)自由基、過氧化脂質(zhì)等有害物質(zhì)的形成,從而延緩人體的衰老。</p><p> (10) 具有防癌抗癌作用</p><p> 亞硝基化合物是食物中存在的一類重要的致癌物質(zhì),其中尤以亞硝胺的致癌性最為突出。維生素C具有較強(qiáng)的還原性,可阻斷亞硝基
19、化進(jìn)程,抑制亞硝胺的形成,有利于預(yù)防胃癌、腸癌等消化道癌癥。維生素C還可促進(jìn)膠原蛋白抗體的形成,膠原蛋白可包圍癌細(xì)胞,從而表現(xiàn)出抗癌作用。</p><p> 1.5維生素c的生產(chǎn)的發(fā)展簡史</p><p> 維生索c的天然來源是薔薇果品、柑桔果品及綠色蔬菜,從它被作為還原性因子(Reducing factor),由動植物器官組織中濃縮分離開始,即迅速進(jìn)入商品化生產(chǎn)。1934年全世界維生
20、素C產(chǎn)量僅為50公斤,60年代中期,全世界維生素c的年生產(chǎn)量已達(dá)5000噸,1979年美國維生素c產(chǎn)量突破萬噸,而全世界維生素C總產(chǎn)量達(dá)到32750噸,1994年全世界維生素C生產(chǎn)能力近8.5萬噸,2002年達(dá)到歷史最高水平12萬噸。維生素C的工業(yè)化生產(chǎn)從其歷史發(fā)展進(jìn)程看可劃分為濃縮提取、化學(xué)合成和細(xì)菌發(fā)酵三個階段。</p><p> 1.5.1 濃縮提取法</p><p> 本世紀(jì)的
21、二、三十年代,人們對于維生素C的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)還不了解,獲取其產(chǎn)品的途徑只是經(jīng)驗(yàn)性地由富含“還原性因子”的生物組織如檸檬、胡桃、野薔薇、辣椒、腎上腺等提取獲得“刪。此法生產(chǎn)成本高,產(chǎn)量有限,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人類社會日益增長的物質(zhì)需求。直至五十年代,仍有企業(yè)使用此法生產(chǎn)維生素C。</p><p> 1.5.2 化學(xué)合成</p><p> 1933年,Reichstein等和Ault等兩個研究小組
22、分別獨(dú)立發(fā)表了維生素c的合成方法。從1937年開始,以Reichstein和Grussner的發(fā)明為基礎(chǔ),建立了以D-葡萄糖為原料,加氨還原成D-山梨醇,然后利用一步發(fā)酵方法和化學(xué)方法合成維生素C的“萊氏法”(Reichstein Procedure),維生素C生產(chǎn)開始進(jìn)入化學(xué)合成階段?!叭R氏法”生產(chǎn)的工藝流程主要包括以下五個步驟:</p><p> 1)D-葡萄糖在鎳的催化作用下,高溫高壓,加氫還原成D-山梨
23、醇;</p><p> 2)D-山梨醇經(jīng)微生物如生黑葡萄糖酸桿菌(Giuconobacter melanogenus)或弱氧化醋酸桿菌(Acetobater suboxydans)發(fā)酵氧化成L-山梨糖;</p><p> 3)L-山梨糖在丙酮和硫酸的作用下,經(jīng)酮化生成雙丙酮-L-山梨糖(Diacetone-L—sorbose簡稱雙酮糖),生產(chǎn)上俗稱丙酸化。再用苯或甲苯提取,提取液經(jīng)水法
24、除去單酮山梨糖后,蒸去溶劑而后分離出雙酮糖;</p><p> 4)雙酮糖在高錳酸鈉氧化,鉑催化下,經(jīng)水解生成2-酮基-L-古龍酸(2-Keto—L—gulonic acid);</p><p> 5)2-酮基-卜古龍酸通過烯醇化和內(nèi)酯化,在酸性或堿性條件下,轉(zhuǎn)化生成維生素C。</p><p> “萊氏法”工藝應(yīng)用于大生產(chǎn)的早期,從D-山梨醇到維生素C的總收率
25、僅為15—18%。此后經(jīng)過不斷的工藝優(yōu)化,目前總收率已達(dá)到60—65%。由于葡萄糖為大宗原料,便宜易得,中間體尤其是雙丙酮-L-山梨糖的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,以及工藝流程的不斷改進(jìn),且產(chǎn)品質(zhì)量好,收率較高,目前在國外發(fā)達(dá)國家仍為維生素C生產(chǎn)的主要工藝”。主要采用“萊氏法”生產(chǎn)的公司包括:瑞士Hoffmann—La—Roche(2003年1月維生素業(yè)務(wù)轉(zhuǎn)讓荷蘭帝斯曼公司),德國BASF和E.Merck。但是,“萊氏法”仍存在著許多不足之處:生產(chǎn)工
26、序復(fù)雜,工藝路線較長,較難連續(xù)化操作,勞動強(qiáng)度大,耗費(fèi)大量有毒、易燃化學(xué)藥品,造成嚴(yán)重的環(huán)境污染等。自六十年代以來,各國研究機(jī)構(gòu)對“萊氏法”工藝改進(jìn)作了大量的研究工作,試圖簡化或以生物氧化法替代以化學(xué)合成為主的“萊氏法”,現(xiàn)在許多重要研究成果已經(jīng)在大生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。</p><p><b> 1.5.3生物發(fā)酵</b></p><p> 六十年代以后,各國生產(chǎn)企業(yè)
27、及科學(xué)家開始探索以細(xì)菌生物酶轉(zhuǎn)化的方法來取代“萊氏法”,相繼提出了諸多反應(yīng)路線,并在此基礎(chǔ)上對有關(guān)反應(yīng)工藝的問題進(jìn)行了探索。已成功應(yīng)用于大生產(chǎn)的細(xì)菌發(fā)酵法是我國七十年代初開發(fā)的“二步發(fā)酵法”。由中國科學(xué)院微生物研究所、北京制藥廠、東北制藥總廠尹光琳、寧文珠等人發(fā)明的“二步發(fā)酵法”從七十年代后期開始正式投產(chǎn),逐漸在國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)普遍采用,現(xiàn)在國內(nèi)四大維生素C生產(chǎn)企業(yè)都采用此法。二步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C的新工藝1980年獲得國家級二等獎?!岸?/p>
28、發(fā)酵法”已經(jīng)在中國、歐洲、日本和美國申請了專利,上海三維制藥有限公司當(dāng)時(shí)具有堅(jiān)實(shí)的科研開發(fā)力量,1985年成功地將維生素C二步發(fā)酵技術(shù)轉(zhuǎn)讓給FHoffmann-la Roche Ltd.,Switzorland(瑞士豪大邁一羅氏公司),成為建國以來最大的一項(xiàng)醫(yī)藥技術(shù)出口項(xiàng)目。該法應(yīng)用于大生產(chǎn)初時(shí),從D-山梨醇到維生素C的總收率平均為百分之四十多,但經(jīng)過近幾年的激烈市場競爭后,一些廠家可超過百分之六十五,最高為72%?!岸桨l(fā)酵法”的工藝
29、路線與“萊氏法”不同之處在于采用大、小混合菌發(fā)酵法代替化學(xué)法轉(zhuǎn)化卜山梨糖合成2-酮基-L-古龍</p><p> Huang等人于1962年首次發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬(Pseudomonas)的某些種具有氧化L-山梨糖積累2-酮基-L-古龍酸的能力,不過其產(chǎn)酸量僅為lg/L(發(fā)酵液含</p><p> 糖為20g/L)。此后相繼發(fā)現(xiàn)了不少具有此氧化能力的細(xì)菌,但糖酸轉(zhuǎn)化率均非常低?!岸桨l(fā)酵法
30、”轉(zhuǎn)化L_山梨糖合成2-酮基-L-古龍酸用的大小菌:產(chǎn)酸菌為氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxans)(俗稱小菌),巨大芽孢桿菌(俗稱大菌)最初為條紋假單胞菌(Ps.striata),目前生產(chǎn)上大菌大多數(shù)企業(yè)使用芽孢桿菌(Bacillus spp)。最初從L-山梨糖到2-酮基-L-古龍酸的轉(zhuǎn)化率僅為39.7%(濃糖度7%,6天),經(jīng)過多方面的改進(jìn),發(fā)酵時(shí)間已經(jīng)縮短至35—60小時(shí),轉(zhuǎn)化率達(dá)82%左右,目前工廠最好已超過8
31、5%(發(fā)酵液含酸量8—10%)。</p><p> “二步發(fā)酵法”的第一步L_山梨糖發(fā)酵與“萊氏法”相同,其七十年代曾發(fā)現(xiàn)有染噬菌體現(xiàn)象,經(jīng)過篩選獲得抗噬菌體菌體,在此基礎(chǔ)上,應(yīng)用于生產(chǎn)上己近二十年,糖酸轉(zhuǎn)化率一直保持在98%以上,且遺傳特性穩(wěn)定。</p><p> “二步發(fā)酵法”盡管比“萊氏法”在工藝流程上有了極大改進(jìn),但此法仍需以D-山梨糖為底物,大生產(chǎn)發(fā)酵過程包括三種菌,菌種操作
32、通常比其它生物發(fā)酵工藝繁瑣,易于污染雜菌:第二步發(fā)酵涉及大小菌株的混合發(fā)酵,其產(chǎn)酸小菌單獨(dú)培養(yǎng)產(chǎn)酸率低,且難以穩(wěn)定傳代,必須要有適宜的大(伴生)菌搭配。為了適應(yīng)日益激烈的維生素c市場的要求,我國各生產(chǎn)企業(yè)非常有必要及時(shí)尋求開發(fā)對自身發(fā)展有利的“二步發(fā)酵法”工藝流程的簡化或優(yōu)化。</p><p> 1.6 兩部發(fā)酵生產(chǎn)古龍酸的反應(yīng)機(jī)理(圖2)</p><p> 圖2 兩部發(fā)酵的生產(chǎn)古龍酸
33、的反應(yīng)機(jī)理</p><p> 1.7 維生素c的市場動態(tài)</p><p> 1.7.1 VC的生產(chǎn)概況</p><p> 1934年,全世界vc年產(chǎn)量僅為50kg,60年代中期達(dá)到5000t,到1995年突破了lO萬t大關(guān)。我國東北制藥總廠和華北制藥集團(tuán)的萬t VC項(xiàng)目投產(chǎn)后,世界VC市場的競爭達(dá)到了白熱化的狀態(tài)。近幾年全球VC市場的實(shí)際銷售量約為每年9~10
34、萬t,而世界VC總生產(chǎn)能力已超過15萬t,因此大部分VC生產(chǎn)企業(yè)的開工率嚴(yán)重不足。</p><p> 1.7.1.1國內(nèi)生產(chǎn)狀況</p><p> 從1958年東北制藥總廠首先投產(chǎn)VC,到上世紀(jì)70年代初我國首創(chuàng)的VC二步發(fā)酵法新工藝試產(chǎn)成功,我國的vc生產(chǎn)已經(jīng)經(jīng)歷了四十余年的發(fā)展,逐漸確立了世界VC生產(chǎn)大國的地位?!傲濉蹦┢?,我國的VC年產(chǎn)量不足4000t。1992年下半年起,由于
35、波黑戰(zhàn)爭的加劇以及甘本Takeda公司遭受強(qiáng)臺風(fēng)襲擊等原因,使得國際市場上VC明顯俏銷?;诔隹诘拇碳ぃ?993年我國的VC生產(chǎn)能力達(dá)到1.5萬t,產(chǎn)量達(dá)到1.2萬t。1996年生產(chǎn)能力則達(dá)到5萬t以上,產(chǎn)量為2.6萬t,生產(chǎn)能力在1993年的基礎(chǔ)上翻了近兩番,產(chǎn)量亦翻了一番。目前,我國vc年產(chǎn)量已經(jīng)接近5萬t。據(jù)報(bào)道,石家莊制藥集團(tuán)將在2004年4月份建成年生產(chǎn)能力3萬t的VC生產(chǎn)線。</p><p> VC
36、是我國最主要的出口創(chuàng)匯原料藥之一。國內(nèi)vc生產(chǎn)廠家較多,生產(chǎn)規(guī)模較大的為:華北制藥集團(tuán)維爾康制藥有限公司、東北制藥總廠、石家莊制藥集團(tuán)維生藥業(yè)有限公司、江蘇江山制藥有限公司。據(jù)統(tǒng)計(jì),2003年上半年我國共向63個國家和地區(qū)出口VC產(chǎn)品,總出口量約2.4萬t,主要出口區(qū)域?yàn)闅W盟、北美、韓國和日本等。</p><p> 1.7.1.2 國外生產(chǎn)狀況</p><p> 國外最早的VC生產(chǎn)始于
37、1938年。此后,VC市場一直看好,許多公司競相建廠投產(chǎn)。目前,全球約有10個國家建有vc生產(chǎn)裝置,主要分布于歐洲、亞洲和美洲。國外生產(chǎn)商主要采用萊氏法生產(chǎn)VC,年生產(chǎn)能力總計(jì)6萬t左右。1986年,Roche公司以550萬美元的價(jià)格從我國購買了二步發(fā)酵法生產(chǎn)VC的技術(shù)。</p><p> 上世紀(jì)80年代,VC價(jià)格大戰(zhàn)一度使Roche公司和Takeda公司等國外VC生產(chǎn)商陷入窘境,但是這些大跨國公司憑借其雄厚財(cái)
38、力,至今仍相對輕松地活躍在世界vc市場上。1998年1月份,Roche公司向其在蘇格蘭Daly的vc工廠投資約2.03億美元,用于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模;2000年初.Roche公司再次擴(kuò)大了該廠的生產(chǎn)規(guī)模。1997年,BASF公司、默克公司以及Cerestar公司合作創(chuàng)辦了一家專門生產(chǎn)VC合成關(guān)鍵中間體——2-氧代古洛糖酸的合資企業(yè),總耗資3000萬美元,由Cerestar公司負(fù)責(zé)提供起始生產(chǎn)原料——山梨醇。2000年9月,美國伊斯特曼化學(xué)品公
39、司與另外4家企業(yè)一道完成了一種抗壞血酸生產(chǎn)新工藝的研發(fā)工作,顯著降低了VC生產(chǎn)成本,并很快應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。</p><p> 多年來,Roche公司、BASF/Takeda公司與我國的四大VC生產(chǎn)商始終牢牢掌握著世界vc市場的命脈。BASF/Takeda公司和Roehe公司兩大集團(tuán)的VC生產(chǎn)能力合計(jì)約為6萬t,而實(shí)際產(chǎn)量可能只占生產(chǎn)能力的60%。</p><p> 1.8 維生素c的科
40、研動態(tài)</p><p> 1.8.1 維生素c的新作用</p><p> 自從人們發(fā)現(xiàn)維生素C具有防治感冒功能以來,已有近三十年的歷史。自此以后,國內(nèi)外研究人員又對其進(jìn)行了不懈探索,發(fā)現(xiàn)維生素C還有更多的功效。</p><p> 1)新的研究發(fā)現(xiàn),維生素C在試管內(nèi)或動物實(shí)驗(yàn)中都能抑制引起胃潰瘍的幽門螺旋桿菌生長</p><p> 2)
41、法國一家醫(yī)院研究發(fā)現(xiàn),適量服用維生素C可以有效抑制尼古丁依賴者的吸煙欲望,甚至可以幫助他們逐漸戒除煙癮。</p><p> 3)最近美國加州的研究人員發(fā)現(xiàn),攝人大劑量的維生素C可以降低血液中過高的鉛含量,血鉛水平過高是影響兒童健康的一個主要因素。</p><p> 4)美國亞拉巴馬大學(xué)的研究人員最近說,因維生素C可以減少機(jī)體緊張的程度,能夠預(yù)防感冒和癌癥等一系列疾病。</p>
42、;<p> 5)美國加利福尼亞大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn),血中維生素C濃度高的女性與濃度低的相比,前者發(fā)生膽石癥的比例減半。</p><p> 6)最近《美國臨床營養(yǎng)學(xué)雜志》指出,服用更大劑量的維生素C,會有助于預(yù)防諸如癌癥、心血管疾病和白內(nèi)障之類的慢性病。</p><p> 7)最近,英國倫敦醫(yī)院的研究人員發(fā)現(xiàn),富含維生素C的飲食,有助于防止心肌梗死、腦卒中的發(fā)生,特別是在冬
43、季</p><p> 8)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)維生素C對血小板具有有效的保護(hù)作用。</p><p> 9)維生素C有糾正婦女陰道菌群失調(diào)癥作用。</p><p> 1.8.2 維生素c生產(chǎn)方法的研究方向</p><p> VC是我國自主知識產(chǎn)權(quán)開發(fā)的首批西藥之一,也是我國最主要的出口創(chuàng)匯原料藥之一。二步發(fā)酵法是我國VC生產(chǎn)的主要工藝方法,然而該法
44、不能直接以葡萄糖為發(fā)酵原料,且涉及二步發(fā)酵三種菌,工序繁瑣。采用基因工程等先進(jìn)技術(shù),選育直接以葡萄糖為發(fā)酵原料的優(yōu)良菌株和優(yōu)化發(fā)酵條件將是我國VC生產(chǎn)技術(shù)研究的主要方向。</p><p> 此外,目前世界上很多國家正嘗試以真核生物為研究對象,利用它們合成VC的代謝途徑開發(fā)更加環(huán)保的生物合成方法。從我國的二步發(fā)酵法推廣后逐步取代萊氏法這一過程可以預(yù)測,隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和更具優(yōu)勢的生物合成VC方法的不斷涌現(xiàn),
45、生物法必將完全取代化學(xué)法在VC生產(chǎn)中的地位。為了保持我國在世界VC生產(chǎn)上的優(yōu)勢地位,必須加強(qiáng)VC生產(chǎn)的基礎(chǔ)研究工作。</p><p> 2 設(shè)計(jì)的內(nèi)容和依據(jù)</p><p><b> 2.1 設(shè)計(jì)題目</b></p><p> 二步發(fā)酵法年產(chǎn)30000噸古龍酸的初步工藝設(shè)計(jì)。</p><p><b>
46、2.2 設(shè)計(jì)依據(jù)</b></p><p> 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院生物工程系下達(dá)的2011屆畢業(yè)設(shè)計(jì)任務(wù)書。</p><p><b> 2.3 設(shè)計(jì)內(nèi)容</b></p><p> 古龍酸的發(fā)酵、提取。</p><p> 2.3.1 編寫設(shè)計(jì)說明書</p><p><
47、;b> ?、購S址選擇及論證</b></p><p> ?、诠琵埶岬纳a(chǎn)工藝確定及論證</p><p> ③生產(chǎn)物料衡算及列表</p><p> ?、芩㈦?、氣、熱量平衡計(jì)算</p><p> ⑤古龍酸的發(fā)酵、提取主要設(shè)備選型及計(jì)算,并列出一覽表</p><p> 2.3.2 設(shè)計(jì)圖紙</p
48、><p><b> ?、購S平面布置圖1張</b></p><p><b> ②工藝流程圖2張</b></p><p> ?、凵a(chǎn)車間設(shè)備布置圖2張</p><p> ④無菌空氣制備流程圖1張</p><p><b> 3 場址選擇</b></p&
49、gt;<p><b> 3.1地區(qū)選擇</b></p><p> 廠址選擇首先要進(jìn)行建廠地區(qū)的選擇。生物發(fā)酵工廠建廠地區(qū)的選擇應(yīng)當(dāng)有利于發(fā)酵工業(yè)的合理布局,有利于地區(qū)經(jīng)濟(jì)和國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,應(yīng)當(dāng)考慮合理利用現(xiàn)有的工業(yè)基地和交通運(yùn)輸條件,或適應(yīng)新工業(yè)基地和中小城鎮(zhèn)建設(shè)的需要,考慮生產(chǎn)和技術(shù)協(xié)作的條件,為原材料供應(yīng)、產(chǎn)品配套、工藝協(xié)作、科學(xué)技術(shù)協(xié)作和信息交流等創(chuàng)造有利條件。<
50、;/p><p> 3.2 場址選擇的總原則</p><p> 場址選擇的總原則是:</p><p> 第一,場址選擇必須符合工業(yè)布局、符合所在地區(qū)、城市規(guī)劃的要求,按照國家有關(guān)法律法規(guī)及建設(shè)前期工作的規(guī)定進(jìn)行。</p><p> 第二,充分利用各地區(qū)的有利條件,避開或客服不利條件,充分利用當(dāng)?shù)厝肆?、物力、?cái)力和自然資源,保護(hù)環(huán)境,節(jié)約用地
51、,不占用良田及經(jīng)濟(jì)效益高的土地,并符合國家現(xiàn)行土地管理、環(huán)境保護(hù)、水土保持等法規(guī)有關(guān)規(guī)定。盡量遠(yuǎn)離風(fēng)景游覽區(qū)和自然保護(hù)區(qū),不污染水源,有利于三廢處理,并符合現(xiàn)行環(huán)境保護(hù)法規(guī)規(guī)定。</p><p> 第三,使企業(yè)接近原料、能源產(chǎn)地和產(chǎn)品消費(fèi)區(qū),消除不合理運(yùn)輸,總體經(jīng)濟(jì)效益好,有利于加快國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平的提高。</p><p><b> 3.3廠址論證</b>
52、;</p><p> 該廠選址位于石家莊藁城縣,藁城市地處河北省西南部,省會石家莊市東側(cè)。境域在東經(jīng)114º39ˊ~114º59ˊ,北緯37º51ˊ~38º18ˊ之間。轄區(qū)總面積836平方公里。北鄰新樂市,南接趙縣境,東與晉州市相連,西與石家莊、正定搭界,東北與無極接壤,西南與欒城毗鄰。市治西距石家莊市31公里,北至首都北京264公里。</p><p&
53、gt;<b> 3.3.1地勢地貌</b></p><p> 藁城市處于太行山東麓河北平原中南部,屬太行山洪積沖積山前傾斜平原。地勢西北高東南低,以1/1500~1/2000的坡降逐漸傾斜,形成典型的山前傾斜平原地貌。境域中部為滹沱河第二沖積扇之脊,地勢較南北兩面略為低洼;北部為磁河沖積扇及磁河、滹沱河之間的河間地帶,海拔65~55米,向東南緩降;南部邊緣為滹沱河、槐河之間的河間地帶,海
54、拔60~39米,向東南緩傾。由于歷史上滹沱河、磁河、槐河等河流的改道和變遷,洪水泛濫、風(fēng)沙等外力作用,形成只都、九門、南董一帶,楊馬村至南孟、梁家莊一帶,張村、北樓、小常安、賈市莊一帶的古河道、洼地、沙崗、沙丘、緩崗、河溝、坑塘等微地貌。20世紀(jì)60年代以后,通過治沙治水平地造田等,使沙崗、河溝、古河道得以治理,逐漸塑造成藁城大地平曠開闊的現(xiàn)狀。</p><p><b> 3.3.2 氣候</b
55、></p><p> 藁城氣候?qū)倥瘻貛О霛駶櫞箨懶约撅L(fēng)氣候。由于地處平原,地勢、地貌對氣候影響不大,氣候因素分布比較均勻,表現(xiàn)為冬冷夏熱的氣候特點(diǎn)。全境四季分明,春季干燥多風(fēng),夏季炎熱多雨,秋季氣溫涼爽,冬季寒冷雨雪稀少。年平均氣溫12.5℃,年極端高溫43.2℃(1961年6月12日),年極端低溫―23.4℃(1985年12月8日)。1月份最冷月平均氣溫―3.5℃,7月份最熱月平均氣溫26.4℃。年平均
56、降水量494毫米,年最大降水量為1007.1毫米(1963年)。7-8月份降水量最多,約占全年的56.2%。年平均太陽輻射總量546.5千卡/平方厘米,年日照時(shí)數(shù)2711.4小時(shí),日照率61.2%。無霜期190天。</p><p> 3.3.3 經(jīng)濟(jì)發(fā)展?fàn)顩r</p><p> 藁城市緊緊圍繞“富民強(qiáng)市、社會和諧穩(wěn)定”的施政目標(biāo),以科學(xué)發(fā)展觀統(tǒng)領(lǐng)經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展全局,按照建設(shè)“省會最大生態(tài)精
57、品衛(wèi)星城”的城市功能定位、“一城三區(qū)八園”的空間布局定位、“省會產(chǎn)業(yè)制造中心和綜合性經(jīng)濟(jì)區(qū)”的產(chǎn)業(yè)發(fā)展三個定位,大力發(fā)展“城郊型”經(jīng)濟(jì),全力打造“實(shí)力藁城、活力藁城、魅力藁城、誠信藁城”四張城市名片,經(jīng)濟(jì)持續(xù)快速健康發(fā)展。綜合經(jīng)濟(jì)實(shí)力連年位居河北省十強(qiáng)縣(市)行列,2004年首次躋身全國縣域經(jīng)濟(jì)基本競爭力百強(qiáng),2006年在全國最具發(fā)展?jié)摿χ行〕鞘邪購?qiáng)評比中名列第20位。2006年,實(shí)現(xiàn)地區(qū)生產(chǎn)總值173.6億元,人均23470萬元,同比
58、增長14.2%。財(cái)政收入完成80118萬元,同比增長13.59%。民營經(jīng)濟(jì)實(shí)現(xiàn)增加值132億元,占全市GDP的76%。城鎮(zhèn)居民可支配收入和農(nóng)民人均純收入分別達(dá)到9841元和5465元,比上年分別增加910元和405元。</p><p> 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá) 藁城市是全國知名的傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)大市,農(nóng)業(yè)綜合生產(chǎn)能力保持全省、全國領(lǐng)先水平。2004—2006年連年榮獲“全國糧食生產(chǎn)先進(jìn)縣標(biāo)兵”第一名。2006年,完成一產(chǎn)增加值3
59、4億元,糧食播種面積達(dá)到99.7萬畝,糧食總產(chǎn)50.4萬噸,蔬菜種植面積53萬畝,總產(chǎn)267萬噸。肉、蛋、奶總產(chǎn)量達(dá)到39萬噸,養(yǎng)殖總量和綜合指標(biāo)排名位居河北省前列。農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化水平不斷提高,擁有5家省級重點(diǎn)龍頭企業(yè)、 72家銷售收入500萬元以上龍頭企業(yè)、5家超億元企業(yè)。2005年6月和2006年2月,溫家寶總理和回良玉副總理先后到藁城視察,對藁城農(nóng)業(yè)給予了充分肯定。</p><p> 工業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展迅速 以園區(qū)
60、經(jīng)濟(jì)和項(xiàng)目建設(shè)為抓手,深入實(shí)施工業(yè)強(qiáng)市戰(zhàn)略,形成了較為完善的工業(yè)經(jīng)濟(jì)體系。園區(qū)集群效應(yīng)明顯,省級石家莊經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)、石家莊循環(huán)經(jīng)濟(jì)化工示范基地和藁城新區(qū)聚集了全市90%以上的大型企業(yè),形成高度聚集的機(jī)械制造、化工、板材、輕紡、醫(yī)藥、禽蛋產(chǎn)銷和農(nóng)產(chǎn)品加工等七大主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)。擁有鏈霉素產(chǎn)量世界第一的華勝制藥公司、半合抗原料藥產(chǎn)量亞洲第一的華藥倍達(dá)公司、全國最大無公害生物獸藥生產(chǎn)企業(yè)愛諾藥業(yè)和金剛石鋸片產(chǎn)量居全國首位的冀凱集團(tuán)等多個世界馳名企業(yè)
61、。項(xiàng)目建設(shè)連創(chuàng)新高,2006年,社會固定資產(chǎn)投資完成61億元,建設(shè)投資超500萬元項(xiàng)目128個,其中78個超千萬元項(xiàng)目、12個超億元項(xiàng)目,有15個項(xiàng)目列入省市重點(diǎn)計(jì)劃,數(shù)量位居石家莊各縣市之首。2006年,完成工業(yè)增加值90億元,占全市GDP的51.4%。規(guī)模以上工業(yè)企業(yè)完成增加值52.1億元、實(shí)現(xiàn)利稅18.86億元,同比分別增長33.8 %和37%。</p><p> 現(xiàn)代服務(wù)業(yè)蓬勃發(fā)展 以市場建設(shè)為龍頭,全
62、市商貿(mào)流通業(yè)快速發(fā)展,形成了比較完善的商貿(mào)流通體系。擁有河北省惟一一家具有“一關(guān)三檢”功能的石家莊內(nèi)陸港及華北地區(qū)最大的系井糧食現(xiàn)貨交易市場、北方最大的藁城禽蛋交易市場等12個農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場,年交易額達(dá)到23億元。通過深入實(shí)施“萬村千鄉(xiāng)“市場工程,農(nóng)村超市遍布全市239個村。2006年,完成三產(chǎn)增加值52.5億元,同比增長12.6%;社會消費(fèi)品零售總額完成45.6億元,同比增長14.95%。</p><p>
63、4 工藝流程設(shè)計(jì)及工藝論證</p><p> 4.1 本設(shè)計(jì)采用二步發(fā)酵法生產(chǎn)古龍酸生產(chǎn)工藝流程</p><p> 二步發(fā)酵法的工藝流程如下:</p><p> 4.2 工藝選擇及論證</p><p> 4.2.1 一步發(fā)酵</p><p> 4.2.1.1 菌種</p><p>
64、; 本設(shè)計(jì)中一步發(fā)酵采用的菌種為生黑葡萄糖酸桿菌,簡稱黑醋菌。最常用的生產(chǎn)菌株為R-30,其主要特征是細(xì)胞呈橢圓至短桿狀,革蘭氏染色陽性,無芽孢大小為(0.5~0.8)×(1.0~2.2)µm,端生鞭毛。菌落邊緣整齊,微顯淺褐色。生長最適溫度為34℃,氧化D-山梨醇的發(fā)酵收率可達(dá)98%以上。2.2.1.2 培養(yǎng)基</p><p> 4.2.1.2.1 培養(yǎng)基</p>&l
65、t;p> 一步一級種子培養(yǎng)基成分(100g水):山梨醇 2g,酵母膏 0.7g,蛋白胨 0.8g,玉米漿 0.7g,碳酸鈣 0.15g,MgSO4 0.02g, KH2PO4 0.1g。</p><p> 一步二級種子培養(yǎng)基成分(100g水):山梨醇 2g,酵母膏 0.5g,尿素 0.1g,玉米漿 0.3g,碳酸鈣 0.15g,MgSO4 0.02g, KH2PO4 0.1g。</p>
66、<p> 一步發(fā)酵液培養(yǎng)基成分(100g水):山梨醇 20g,酵母膏 0.5g,尿素 0.1g,玉米漿 0.3g,碳酸鈣 0.1g。</p><p> 4.2.2 二步發(fā)酵</p><p> 4.2.2.1 菌種</p><p> 本設(shè)計(jì)中二步發(fā)酵采用的菌種為大、小菌的混合菌,小菌為氧化葡萄糖酸桿菌,大菌可采用巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌(Baci
67、llus cereus)或浸麻芽孢桿菌(Bacillus macerans)。</p><p> 小菌形態(tài)特征為細(xì)胞橢圓至短桿狀,革蘭氏染色陰性,無芽孢,0.3~0.7×0.6~1.2µm ,單個或成對排列。菌落呈圓點(diǎn)狀,表面微突起,邊緣整齊,無色透明。最適生長溫度25~30℃。 大菌的形態(tài)特征為桿狀,端圓,革蘭氏染色陽性,無芽孢,單個或成對排列,0.4×1.0~1.8 µ
68、;m,菌落具紫色熒光,光滑。最適生長溫度28~37℃。 </p><p> 混合發(fā)酵中大菌和小菌的關(guān)系:在大、小菌的混合培養(yǎng)中,兩者的增殖是同步進(jìn)行的。小菌是2 - KL G 合成的主體,大菌一方面直接參與2 - KLG 的合成過程,一方面對小菌的生長起促進(jìn)作用。小菌合成的2 - KLG對大菌的生長增殖有明顯的抑制作用,而大菌的存在卻是小菌的生長增殖和合成2 - KLG所必需的。深入研究發(fā)現(xiàn),大菌的胞內(nèi)液和胞
69、外液均可促進(jìn)小菌的生長,大菌胞外液中具有該作用的組分的分子量在100kD 以上。此外,胞外液還具有促進(jìn)小菌轉(zhuǎn)化I - 山梨糖生成2 - KLG的作用,具有該作用的組分包括30 - 50kD 和大于100kD 兩部分,其中前者系一種含鐵和鋅的蛋白質(zhì)。二者必須保持適當(dāng)?shù)谋壤?。其比例通常為大?小菌=1:1.2~1.4。</p><p> 4.2.2.2 培養(yǎng)基</p><p> 二步一級種
70、子培養(yǎng)基成分:酵母膏0.3%,牛肉膏0.3%,玉米漿0.3%,蛋白胨1.0%,尿素0.1%,山梨糖2.0%,磷酸二氫鉀0.1%,硫酸鎂0.02%,碳酸鈣0.1%。</p><p> 二步二級種子培養(yǎng)基成分:酵母膏0.6%,牛肉膏0.4%,玉米漿0.5%,蛋白胨1.0%,尿素0.1%,山梨糖6.0%,磷酸二氫鉀0.1%,硫酸鎂0.02%,碳酸鈣0.1%。</p><p> 二步發(fā)酵液培養(yǎng)
71、基成分為:玉米漿1.5%,尿素1.2%,L-山梨糖8%,磷酸二氫鉀0.1%,硫酸鎂0.01%,碳酸鈣0.5%。</p><p><b> 4.3 滅菌</b></p><p> 培養(yǎng)基配成后首先要滅菌,滅菌是否徹底,關(guān)系到生產(chǎn)的成敗,因污染會使發(fā)酵受到重大的損失。因此,培養(yǎng)基滅菌是保證生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。然而高溫雖然能殺死培養(yǎng)基中的雜菌,但也會破壞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分,
72、甚至產(chǎn)生不利于菌體生長的物質(zhì)。因此,在工業(yè)生產(chǎn)中,除了盡可能殺死培養(yǎng)基中的雜菌外,還要盡可能的減少培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的損失。</p><p> 培養(yǎng)基滅菌的基本方法比較多,可以利用化學(xué)藥品殺滅培養(yǎng)基中的雜菌,但培養(yǎng)基中會有殘留的藥品;電磁波、射線、射線、聲波輻射等殺菌僅在實(shí)驗(yàn)上小規(guī)模有效;蒸汽滅菌沒有毒性物質(zhì)遺留,蒸汽的取得也比較容易,操作也比較方便,故適用于大規(guī)模的發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)。</p><
73、p> 4.3.1 連續(xù)滅菌</p><p> 連續(xù)滅菌是將培養(yǎng)基通過專門設(shè)計(jì)的滅菌器進(jìn)行連續(xù)流動滅菌后,進(jìn)入預(yù)先滅過菌的發(fā)酵罐中的滅菌方式,工廠里也稱連消。</p><p> 連續(xù)滅菌的加熱、保溫和冷卻3 個階段分別在不同的專有設(shè)備中進(jìn)行。由于培養(yǎng)基能在短時(shí)間內(nèi)被加熱到保溫溫度,并能很快被冷卻,因此可在比分批滅菌更高的溫度下滅菌。滅菌時(shí)間縮短,有利于減少營養(yǎng)物質(zhì)的破壞。連續(xù)滅菌
74、所用蒸汽壓力一般高于5 ×105 Pa (表壓) 。</p><p> 連續(xù)滅菌采用高溫快速滅菌法,對培養(yǎng)基破壞小,且組成培養(yǎng)基的不同成分(耐熱與不耐熱,糖與氮源)可在不同溫度分開滅菌,可實(shí)現(xiàn)自動控制,提高發(fā)酵罐的設(shè)備利用率,蒸汽用量平衡,節(jié)省冷卻水,但其對加熱蒸汽的壓力要求高,一般不小于0.45MPa,同時(shí),連續(xù)滅菌需要一組附屬設(shè)備,設(shè)備投資大,蒸汽用量大。</p><p>
75、 4.3.2 分批滅菌</p><p> 分批滅菌是將配置好的培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐中,用飽和蒸汽加熱,使培養(yǎng)基和設(shè)備同時(shí)滅菌的一種滅菌方式,工廠里稱實(shí)消。</p><p> 分批滅菌也稱實(shí)罐滅菌,全過程包括升溫、保溫、降溫3 個階段,這3 個階段分別對孢子的殺滅和培養(yǎng)基有效成分的破壞做出不同的貢獻(xiàn)。滅菌主要在保溫過程實(shí)現(xiàn),但升溫的后期和冷卻的初期培養(yǎng)基的溫度高,因而也有一定的滅菌效果。&
76、lt;/p><p> 分批滅菌無需專門的滅菌設(shè)備,設(shè)備投資少,滅菌效果可靠,對滅菌用蒸汽要求低(0.2~0.3MPa表壓),蒸汽利用率高,節(jié)約勞動力,但因其滅菌溫度低,時(shí)間長對培養(yǎng)基成分破壞大,罐的利用率低,其操作要求難以實(shí)現(xiàn)自動控制。</p><p> 綜上所述,由于本設(shè)計(jì)采用分批流加L-山梨糖的方式發(fā)酵,且年產(chǎn)量較大,故本設(shè)計(jì)采用連續(xù)滅菌方式對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。</p>&
77、lt;p> 4.4 空、實(shí)罐滅菌,連消滅菌及管道滅菌的具體操作</p><p> 發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,對于內(nèi)部的邊邊角角不容易消毒,一般的發(fā)酵罐有自動清洗裝置,清洗完之后徹底滅菌。為保證整個發(fā)酵系統(tǒng)無菌,從管道通入蒸汽,使罐內(nèi)蒸汽壓力達(dá)0.147MPa,維持45分鐘,滅菌過程從有關(guān)閥門、邊閥排出空氣,并使蒸汽通過達(dá)到死角滅菌。滅菌完畢,關(guān)閉蒸汽后,待罐內(nèi)壓力低于空氣過濾器壓力時(shí),通入無菌空氣保壓0.0
78、98MPa。</p><p><b> a)空罐滅菌</b></p><p> 空罐滅菌(空消)即發(fā)酵罐罐體的滅菌。空消時(shí)一般維持罐壓0.15~0.2Mpa,罐溫125~130℃,保持30~45min;要求總蒸汽壓力不低于0.3~0.35Mpa,使用汽壓不低于0.25~0.3MPa。</p><p><b> 空罐消毒的操作是:
79、</b></p><p> ( 1) 滅菌前, 用清水沖去罐內(nèi)泡沫等剩余料液( 升溫殺菌后放去) , 洗罐畢, 緊固料孔, 用棉花團(tuán)塞好視孔玻璃, 以防高溫時(shí)破裂;</p><p> ( 2) 打開排氣口和各路管道, 以保證升溫時(shí)充分排氣, 防止死角;</p><p> ( 3) 通入蒸汽, 在0.2 兆帕( 2kg/cm2) 表壓下, 保持30m
80、in, 遇有雜菌感染時(shí)應(yīng)適當(dāng)延長;</p><p> ( 4) 空罐滅菌的同時(shí), 要進(jìn)行尿素、消泡劑和接種等有關(guān)管道的滅菌, 并進(jìn)行空氣保壓。</p><p><b> b)實(shí)罐滅菌</b></p><p> 實(shí)罐滅菌(實(shí)消)是在培養(yǎng)基滅菌之前,通常應(yīng)先將與罐相連的分空氣過濾器用蒸汽滅菌并用空氣吹干。在引入無菌空氣前,應(yīng)注意罐壓必須低于過
81、濾器壓力,否則物料將倒流入過濾器內(nèi),后果嚴(yán)重!滅菌時(shí),總蒸汽管道壓力要求不低于0.3~0.35Mpa,使用壓力不低于0.2Mpa。</p><p> 實(shí)罐滅菌時(shí)的操作是:</p><p> 1)先將輸料管路內(nèi)的污水放掉沖凈,然后將配制好的培養(yǎng)基泵送至發(fā)酵罐(種子罐或料罐)內(nèi),同時(shí)開動攪拌器進(jìn)行滅菌。</p><p> 2)滅菌前先將各排氣閥打開,將蒸汽引入夾套
82、或蛇管進(jìn)行預(yù)熱,待罐溫升至80~90℃,將排氣閥逐漸關(guān)小。</p><p> 3)接著將蒸汽從進(jìn)氣口、排料口、取樣口直接通入罐中(如有沖視罐也同時(shí)進(jìn)汽),使罐溫上升到118~120℃,罐壓維持在0.09~0.1Mpa(表壓),并保持30min左右。各路進(jìn)氣要暢通,防止短路逆流,罐內(nèi)液體翻動要激烈;各路排汽也要暢通,但排汽量不宜過大,以節(jié)約用氣量。</p><p> 4)在保溫階段,凡進(jìn)
83、口在培養(yǎng)基液面以下的各管道及沖視鏡管都應(yīng)進(jìn)汽;凡開口在液面之上者均應(yīng)排汽。無論與罐連通的管路如何配制,在實(shí)消時(shí)均應(yīng)遵循“不進(jìn)則出”的原則。這樣才能保證滅菌徹底,不留死角。</p><p> 5)保溫結(jié)束后,依次關(guān)閉各排汽、進(jìn)汽閥門,待罐內(nèi)壓力低于空氣壓力后,向罐內(nèi)通入無菌空氣,在夾套或蛇管中通冷卻水降溫,使培養(yǎng)基的溫度降到所需的溫度,進(jìn)行下一步的發(fā)酵和培養(yǎng)。 </p><p><b
84、> c)連續(xù)滅菌</b></p><p> 連續(xù)滅菌(連消):將配好的培養(yǎng)基連續(xù)加熱升溫、保溫滅菌和冷卻降溫。 </p><p><b> 其特點(diǎn)是:</b></p><p> ?。?) 提高產(chǎn)量,設(shè)備利用率高。</p><p> (2)培養(yǎng)基受熱時(shí)間較短,所含營養(yǎng)成分破壞較少。</p&g
85、t;<p> (3)蒸汽負(fù)荷均衡,操作方便。</p><p> ?。?)降低了勞動強(qiáng)度,適宜自動控制。需要專門設(shè)備,投資較大,設(shè)備多染菌機(jī)會也相應(yīng)較多 。 </p><p><b> 要求是:</b></p><p> 培養(yǎng)基受熱時(shí)間要短,營養(yǎng)成分的損失要少;熱效率要高,能量消耗要少。</p><p>
86、; ?、?加熱設(shè)備:短時(shí)間內(nèi)加熱均勻一致,達(dá)到滅菌溫度;</p><p> ②.維持設(shè)備:使培養(yǎng)基按順序流動,維持滅菌溫度達(dá)到滅菌時(shí)間;</p><p> ?、?冷卻設(shè)備:密封性好,快速冷卻到發(fā)酵要求溫度,傳熱速率高,回收熱能。</p><p> 工藝流程如下(圖3):</p><p> 圖3 連消-噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程</p&g
87、t;<p> 配好的培養(yǎng)基用泵打入連消塔與蒸汽直接混合,達(dá)到滅菌溫度后進(jìn)入維持罐,維持一定時(shí)間后經(jīng)噴淋冷卻器冷卻至一定溫度后進(jìn)入發(fā)酵罐。</p><p> 4.5 無菌空氣制備</p><p> 在發(fā)酵過程中,微生物的生長和繁殖需要大量的氧氣,這就需要輸入大量的空氣來提供氧氣??諝庵械奈⑸锒酁榧?xì)菌、細(xì)菌孢子,也有真菌、酵母和病毒,其大小從幾微米到幾百微米不等,小的微生
88、物附在空氣中的灰塵上,灰塵的平均尺寸約為011μm。粗濾器可將粗的微粒除去,015~210μm 的微粒及細(xì)菌微生物由空氣過濾器除去。</p><p><b> 空氣除菌方法:</b></p><p> (1) 加熱滅菌。利用空氣被壓縮時(shí)所產(chǎn)生的熱來滅菌,為了保證壓縮后的空氣具有較高的溫度,將壓縮空氣出口管包裹保溫層。在單級絕熱壓縮機(jī) (29412 kPa) 運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)
89、,吸進(jìn)的空氣溫度為20 或27 ℃時(shí),壓縮后出口空氣的溫度分別上升到150 或270 ℃。這種滅菌方法必須保證有足夠的滅菌時(shí)間,為了徹底除菌,必須在罐前安裝1 個空氣過濾器。</p><p> (2) 輻射滅菌。波長22615~32817 nm 的紫外線對空氣中微生物的殺菌效力最強(qiáng),但設(shè)備投資高,在發(fā)酵工業(yè)中還很少應(yīng)用。</p><p> (3) 化學(xué)滅菌。使空氣在殺菌劑溶液中通過或?qū)?/p>
90、殺菌劑溶液噴灑于空氣中的微生物上,但必須除去帶殺菌劑的水氣和霧后才能應(yīng)用。</p><p> (4) 靜電除塵。靜電除塵的特點(diǎn)是能量消耗少,空氣的壓頭損失小,為400~2 000 Pa ;對1μm 的塵粒捕集效率可達(dá)99 %以上,缺點(diǎn)是設(shè)備龐大。</p><p> (5) 介質(zhì)過濾。發(fā)酵工業(yè)制備無菌空氣廣泛采用纖維過濾器。</p><p> 比較理想的空氣除菌
91、流程應(yīng)具備以下特點(diǎn):①高空采風(fēng),吸氣風(fēng)管設(shè)置在工廠上方高為20~30m處,減少吸入空氣的細(xì)菌含量; ②在空壓機(jī)空氣入口處安裝中效或高效前置過濾器,以減輕總過濾器的負(fù)荷; ③采用無油潤滑壓縮機(jī),減少壓縮后空氣中的油霧污染; ④壓縮機(jī)后部采用冷卻型的空氣儲罐,可降低空氣的溫度,同時(shí)除去部分潤滑油; ⑤采用二級冷卻二級旋風(fēng)分離器,使油水分離較完全; ⑥采用旋風(fēng)金屬網(wǎng)除霧器,除去空氣中的霧滴; ⑦用蒸汽加熱器將空氣加熱至約50 ℃,使空氣的相對
92、濕度低于60 % ,再進(jìn)入總過濾器,以保證總過濾器保持干燥狀態(tài); ⑧空氣經(jīng)總過濾器進(jìn)入分過濾器,再進(jìn)入發(fā)酵罐,空氣的除菌程度達(dá)到99.999 %。</p><p> 下圖(圖4)是一個典型的除菌流程,在本設(shè)計(jì)中基本上采用該流程。</p><p> 圖4 兩級冷卻、加熱除菌加熱流程</p><p> 流程:將壓縮空氣冷卻到30~35℃、相對濕度為60%~70%以
93、下。</p><p> 首先粗過濾器捕集空氣中較大的灰塵顆粒,起到保護(hù)空氣壓縮機(jī),防止其受磨損的作用。同時(shí)也可減輕空氣過濾的負(fù)擔(dān)。然后空氣進(jìn)入壓縮機(jī)壓縮后到達(dá)貯罐,貯罐的作用是消除壓縮機(jī)排除空氣量的脈沖,維持穩(wěn)定的空氣壓力,同時(shí)也可以利用重力沉降作用分離部分油霧??諝庠俳?jīng)冷卻后,進(jìn)入旋風(fēng)分離器將空氣中被冷凝成霧狀的水霧和油霧除去。經(jīng)第二個冷卻器使空氣進(jìn)一步冷卻,析出較小的霧粒,再經(jīng)具有較高分離效率的絲網(wǎng)分離器,
94、除去較細(xì)小的霧狀微粒。適當(dāng)加熱后,最后經(jīng)過濾器完成空氣的過濾除菌操作。</p><p> 特點(diǎn):流程最簡單,所用設(shè)備最少適用于北方和內(nèi)陸氣候干燥地區(qū)。</p><p><b> 4.6 發(fā)酵方式</b></p><p> 發(fā)酵方式有分批、連續(xù)、半連續(xù)和分批-補(bǔ)料四種。</p><p> 分批發(fā)酵在工業(yè)生產(chǎn)上仍有重
95、要地位.采用分批作業(yè)有技術(shù)和生物上的理由,即操作簡單,周期短,染菌的機(jī)會減少和生產(chǎn)過程、產(chǎn)品質(zhì)量易掌握。但是分批發(fā)酵不適用于測定其過程動力學(xué),因使用復(fù)合培養(yǎng)基,不能簡單地運(yùn)用Monod方程來描述生長,存在基質(zhì)抑制問題,出現(xiàn)二次生長現(xiàn)象。如對基質(zhì)濃度敏感的產(chǎn)物,或者次級代謝物,抗生素,用分批發(fā)酵不合適,因其周期短,一般在1-3天,產(chǎn)率較低,這是由于養(yǎng)分的耗竭,無法維持下去。</p><p> 連續(xù)發(fā)酵方式易染菌,
96、產(chǎn)物濃度低,菌種易退化,效率低,工業(yè)上一般不采用。</p><p> 半連續(xù)發(fā)酵方式技術(shù)上受限制;發(fā)酵液被稀釋后可能產(chǎn)生更多的代謝有害物,最終限制發(fā)酵產(chǎn)物的合成;一些經(jīng)代謝產(chǎn)生的前體可能丟失;有利于非產(chǎn)生菌突變株的生長;而且效率比較低。</p><p> 分批-補(bǔ)料發(fā)酵方式與分批發(fā)酵方式相比可解除營養(yǎng)物質(zhì)抑制、產(chǎn)物反饋抑制和分解產(chǎn)物的阻遏作用,通過補(bǔ)稀料,可降低發(fā)酵液的黏度,提高傳氧速
97、率,可使發(fā)酵系統(tǒng)處于準(zhǔn)穩(wěn)定狀態(tài),且重復(fù)進(jìn)行,便于理論研究;與連續(xù)發(fā)酵方式相比,發(fā)酵時(shí)間短,不存在染菌難題,不造成菌種老化和變異,最終產(chǎn)物濃度高,有利用產(chǎn)物的分離,隨著菌體生長消耗快,需要中間補(bǔ)料,工業(yè)上廣泛采用。而且,分批-補(bǔ)料發(fā)酵還能在一種系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度,從而避免快速利用氮源的阻遏效應(yīng)和能夠按設(shè)備的通氣能力去維持適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件,并且能減緩代謝有害物的不利影響。</p><p> 根據(jù)以上論證,本設(shè)計(jì)
98、采用分批-補(bǔ)料的發(fā)酵方式。</p><p><b> 4.7 發(fā)酵罐</b></p><p> 本設(shè)計(jì)采用氣升式發(fā)酵罐。氣升式發(fā)酵罐是上世紀(jì)末開始發(fā)展應(yīng)用的一種新型生物反應(yīng)器,無機(jī)械攪拌機(jī)構(gòu)最大限度的減少了染菌率,減少了機(jī)械剪切力,對長菌絲的各種真菌尤為適宜,氣體提升充分的氣液混合使氧氣的傳遞利用極大提高,特別適合高粘度培養(yǎng)基和對于溶氧要求高的產(chǎn)品。氣升罐可根據(jù)用
99、戶要求設(shè)計(jì)內(nèi)循環(huán)和外循環(huán)兩種,也可以衍生設(shè)計(jì)制造光照生物反應(yīng)器,廣泛應(yīng)用于光合細(xì)菌、藻類的培養(yǎng)。</p><p><b> 4.8 古龍酸發(fā)酵</b></p><p> 4.8.1 一步發(fā)酵菌種液的制備</p><p> 無菌條件下,用接種環(huán)挑取斜面菌苔一環(huán),接入三角瓶種液培養(yǎng)基中,將菌苔打散,于35℃靜止培養(yǎng)60h, 鏡檢菌體正常,無雜
100、菌,可進(jìn)行下一步操作。</p><p> 4.8.2 一步一級種子的培養(yǎng)</p><p> 在pH5.4、120℃保溫30min滅菌,待罐溫冷卻至30~34℃,將菌種液接入已滅菌冷卻的種子培養(yǎng)基中,通入無菌空氣(1vvm),維持罐壓0.03~0.05MPa,條件下培養(yǎng)20h。</p><p> 4.8.3一步二級種子的培養(yǎng)</p><p&g
101、t; 在pH5.4、120℃保溫30min滅菌,待罐溫冷卻至30~34℃,將一步一級種子接入已滅菌冷卻的種子培養(yǎng)基中,通入無菌空氣(1vvm),維持罐壓0.03~0.05MPa,條件下培養(yǎng)20h。</p><p> 4.8.4 一步發(fā)酵</p><p> 在pH5.4~5.6,蒸汽滅菌冷卻后,按接種量為10%接入二級種子培養(yǎng)液。在31~34℃,通入無菌空氣(0.7vvm),發(fā)酵罐壓0
102、.03~0.05MPa條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)發(fā)酵率≥95%,pH值在7.2左右,糖量不再上升時(shí)即為發(fā)酵終點(diǎn)。約為25小時(shí)。</p><p> 發(fā)酵結(jié)束后對山梨糖醪液80℃加熱10min,冷卻至30℃,再開始進(jìn)行第二步混合菌株發(fā)酵。</p><p> 4.8.5 一步發(fā)酵的影響因素</p><p> ?、傺趸俾逝c山梨醇的濃度有很大關(guān)系。濃度≥25%,形成底物抑制;≥
103、40%,通氣速率低,細(xì)菌幾乎無作用,但濃度過低,則需龐大的發(fā)酵罐及濃縮設(shè)備,設(shè)備利用率低,選用濃度一般不大于25%。</p><p> ?、诎l(fā)酵液中加生物催化劑(如維生素B族、玉米漿、酵母)能提高發(fā)酵率。</p><p> ③發(fā)酵液中金屬離子的存在抑制細(xì)菌脫氫活性,鎳離子抑制作用最強(qiáng)。因而控制山梨醇中鎳≤5mg/kg,鐵≤70mg/kg。</p><p> ?、芸?/p>
104、氣流量(vvm)越大越有利于發(fā)酵,但過大,動力消耗大,且泡沫量增大,一般生產(chǎn)上控制在0.7~1.0vvm。</p><p> 4.8.6 二步發(fā)酵混合菌種液的制備</p><p> 冷凍管的大、小菌種活化,分離及混合培養(yǎng)后移入三角瓶種液培養(yǎng)基中,在29~33℃振蕩培養(yǎng)24h,當(dāng)產(chǎn)酸量在6~9 mg/m1,pH值降至7以下,菌形正常無雜菌,即可接入種子罐。</p><
105、p> 4.8.7 二步一級種子的培養(yǎng)</p><p> 一級種子罐內(nèi)加入滅菌培養(yǎng)基,控制溫度30℃,以10%(V/ V) 接種量接種到種子罐培養(yǎng)基中,通入無菌空氣,維持罐壓為0.05MPa,pH6.7~7.0,至產(chǎn)酸量達(dá)合格濃度,且不再增加時(shí),即可接入二級種子罐培養(yǎng)。 </p><p> 4.8.8 二步二級種子的培養(yǎng)</p><p> 二級種子罐內(nèi)
106、加入滅菌培養(yǎng)基,控制溫度30℃,以10%(V/ V) 接種量接種到種子罐培養(yǎng)基中,通入無菌空氣,維持罐壓為0.05MPa,pH6.7~7.0,種子液產(chǎn)酸量達(dá)到10 - 14mg/mL 后接入二步三級發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。</p><p> 4.8.9 二步發(fā)酵</p><p> 發(fā)酵培養(yǎng)基含有8% (W /V)的L - 山梨糖,接種量為10%。在整個發(fā)酵過程中, 溶氧控制在30%左右,
107、溫度為29 ±1℃,自動控制流加Na2CO3堿溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為6. 5~6. 7,在發(fā)酵過程中每隔4h取樣,鏡檢并測其殘?zhí)羌? - 酮基- L - 古龍酸含量。當(dāng)殘?zhí)墙抵?. 42%以下時(shí),發(fā)酵結(jié)束。</p><p> 4.8.10 影響二步發(fā)酵產(chǎn)率的主要因素</p><p><b> ?、偕嚼嫣浅跏紳舛?</b></p><p&g
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