斑馬魚補體調節(jié)因子CFI基因的鑒定、功能初探及CFH家族成員的急相反應.pdf

1、補體調節(jié)因子I(CFI)是哺乳動物補體系統(tǒng)的重要組成成分，發(fā)揮著免疫調節(jié)的作用，在輔因子C4bp、MCP和CFH的作用下通過酶解C3b和C4b分子調節(jié)補體系統(tǒng)的過度激活。已有研究表明哺乳動物中CFI有重要作用，且與疾病發(fā)生相關，但CFI在其它物種中研究較少。斑馬魚作為一種重要的模式動物，其基因組測序已經(jīng)完成，與人類基因的保守性高達85％，這使得斑馬魚適于研究基因的表達與功能。本論文成功從斑馬魚中克隆了補體因子CFI，并分析了其特征、表達

2、，對功能進行了初步探索，同時對CFI的輔因子CFH在胚胎發(fā)育中的表達模式及其對LPS和LTA感染的應答進行了分析。
　　 斑馬魚CFI mRNA全長為2384bp，其中編碼區(qū)為2193bp，編碼含731個氨基酸的蛋白質，多肽鏈的分子量為81.4kDa，等電點pI為6.17。與其它脊椎動物CFI蛋白的同源比對結果顯示序列相似性高達35.5％-67.1％，且序列中存在大量保守的半胱氨酸。CFI蛋白具有一段由18個氨基酸組成的信號肽和

3、5個保守域，即FIMAC、SRCR、LDLr1、LDLr2和SP結構域。在信號肽與FIMAC結構域之間還有一段特異性的序列，這段序列可能是魚類所特有的。成熟的CFI是由重鏈和輕鏈組成的異質二聚體，F(xiàn)IMAC、SRCR、LDLr1和LDLr2組成重鏈，SP結構域組成輕鏈，在輕鏈中存在保守的催化三聯(lián)體His-Asp-Ser和一個位于催化部位底部的Asp殘基。作為一種分泌型糖蛋白，斑馬魚的CFI序列中含有O-糖基化位點和N-糖基化位點，O-糖

4、基化位點主要位于信號肽和FIMAC結構域之間的特異性序列區(qū)域，N-糖基化位點則分散存在于整個CFI序列之中。蛋白結構預測顯示斑馬魚CFI蛋白同人CFI蛋白的空間結構具有很高的相似性，這預示它們功能上的相似性。進化分析顯示，CFI蛋白在進化上高度保守，哺乳動物CFI基因聚為一枝，斑馬魚與硬骨魚的CFI蛋白聚為一枝。LDLr1結構域和LDLr2結構域的進化樹中兩個結構域各聚為一簇，在每一個結構域的分枝中表現(xiàn)出與CFI蛋白全長進化樹相同的聚類

5、趨勢。實時定量PCR檢測結果顯示斑馬魚CFI基因在各組織中廣泛表達，其中在卵巢、精巢、肝臟、腦、腸和眼中的表達量很高。當受到LPS感染時，CFI在肝臟中的表達量上調。CFI基因和CFH家族基因在不同發(fā)育時期胚胎中具有不同的表達模式，CFI基因在胚胎發(fā)育的體節(jié)期表達量最多，而大部分CFH家族成員在1dpf胚胎中表達量開始顯著增多，其中CFHL4在胚胎發(fā)育整個過程中都具有很高的表達量。在體節(jié)期，當胚胎受到LPS和LTA感染時，CFI基因的表

6、達量顯著下調，而CFH家族基因在胚胎發(fā)育不同時期則呈現(xiàn)不同的應答趨勢，且表達量變化顯著。推測CFH家族基因在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，通過多種形式對補體途徑進行著精確的調控。胚胎整體原位雜交結果顯示，CFI基因在胚胎發(fā)育的過程中在卵黃合胞體上一直具有特異性表達，在體節(jié)期時信號最強。當胚胎發(fā)育至1天時，CFI基因在松果體中也出現(xiàn)特異性表達。這提示CFI除了參與補體調節(jié)外，可能在早期發(fā)育過程中也起重要作用。初步實驗表明過表達CFImRNA并沒有