中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)大顎器的生理功能及其對卵巢發(fā)育的內(nèi)分泌調(diào)控.pdf

1、為闡明甲基法呢酯在中華絨螯蟹卵巢發(fā)育中的調(diào)控作用。離體培養(yǎng)法研究了去眼柄(Eyestalk ablation，ESA)不同天數(shù)后的中華絨螯蟹大顎器以及X-器官竇腺對卵巢發(fā)育的影響。將大顎器與離體卵母細(xì)胞共培養(yǎng)作為實驗組1,大顎器和X-器官竇腺與卵母細(xì)胞共培養(yǎng)作為實驗組2,僅添加培養(yǎng)培養(yǎng)液作為對照組。通過測量卵母細(xì)胞直徑的變化探討大顎器對卵巢發(fā)育的影響。另外切除中華絨螯蟹眼柄誘發(fā)大顎器活性,通過檢測ESA處理不同天數(shù)的大顎器中法呢酸甲基轉(zhuǎn)

2、移酶以及性腺中卵黃蛋白原基因表達(dá)量的變化探討去眼柄對大顎器以及性腺發(fā)育的影響。用活體注射法,分別使用0.5μg/mL和1μg/mL甲基法呢酯各20μL連續(xù)5天活體注射中華絨螯蟹,測定血淋巴和性腺中Na+/K+-ATP酶活力。離體培養(yǎng)法研究了甲基法呢酯對性腺中卵黃蛋白原mRNA表達(dá)的影響,在離體培養(yǎng)的中華絨螯蟹卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10-8mol/L甲基法呢酯,熒光定量PCR法分析卵黃蛋白原基因的相對表達(dá)情況。此外,本實驗中使用蛋白激酶C激

3、動劑或抑制劑處理中華絨螯蟹離體培養(yǎng)的卵母細(xì)胞。通過測定卵黃蛋白原mRNA表達(dá)的變化情況初步探討甲基法呢酯促進(jìn)性腺發(fā)育的信號傳導(dǎo)途徑。通過上述實驗得到以下結(jié)果。
　　1.去眼柄后對中華絨螯蟹卵母細(xì)胞發(fā)育的影響
　　去眼柄后1,3,6,14天的大顎器分別培養(yǎng)中華絨螯蟹卵母細(xì)胞24小時,均能夠極顯著地促進(jìn)中華絨螯蟹卵母細(xì)胞的發(fā)育(P<0.01)。且ESA處理第6天的大顎器的促進(jìn)作用最強(qiáng)。加入X-器官竇腺復(fù)合體和ESA處理不同天數(shù)的

4、大顎器培養(yǎng)卵母細(xì)胞。ESA處理第1,3天的大顎器對卵母細(xì)胞直徑影響同對照組相比沒有顯著性差異(P>0.05)。同對照組相比,ESA處理第6,14天的大顎器使卵母細(xì)胞直徑極顯著增加(P<0.01)。ESA處理相同天數(shù)的大顎器培養(yǎng)卵母細(xì)胞,由于實驗組2加入X-器官竇腺復(fù)合體,同實驗組1相比其卵母細(xì)胞的直徑均明顯減小(P<0.01)。大顎器中的功能性物質(zhì)能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育,X-器官竇腺能夠抑制離體卵母細(xì)胞的發(fā)育。
　　2.去眼柄后對法

5、呢酸甲基轉(zhuǎn)移酶以及卵黃蛋白原mRNA表達(dá)量的影響
　　ESA處理后大顎器中法呢酸甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)水平呈上升趨勢。以未去眼柄的中華絨螯蟹法呢酸甲基轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)豐度作為對照組,在ESA處理后的1天和3天其表達(dá)豐度同對照組相比無顯著性差異(P>0.05),然而第6和14天表達(dá)豐度同對照組相比極顯著上升至265％(P<0.01)。ESA處理后,與對照組相比性腺中VTG mRNA被顯著誘導(dǎo),隨著時間的增加,誘導(dǎo)效果增加。ESA處

6、理后第6天,VTG mRNA表達(dá)量是對照組的545.62倍。X-器官竇腺復(fù)合體能夠抑制大顎器中法呢酸甲基轉(zhuǎn)移酶以及性腺卵黃蛋白原基因表達(dá)。
　　3.注射甲基法呢酯對Na+/K+-ATP酶活力的影響
　　給中華絨螯蟹注射0.5μg/mL和1μg/mL甲基法呢酯各20μL。5天后,實驗組血淋巴中的Na+/K+-ATP酶活力明顯高于對照組,其中0.5μ g/ml實驗組Na+/K+-ATP酶活力較對照組提高88%,差異顯著(P<0.

7、01);1μ g/ml實驗組Na+/K+-ATP酶活力,約為對照組2.87倍,差異顯著(P<0.01)。注射甲基法呢酯能夠促進(jìn)血淋巴Na+/K+-ATP酶活性的增加。實驗組性腺中Na+/K+-ATP酶活力明顯高于對照組。同對照組相比,0.5μ g/ml組Na+/K+-ATP酶活力上升了48.2%,差異顯著(P<0.01);1μ g/ml組約為對照組1.83倍,差異顯著(P<0.01)。說明在體注射甲基法呢酯能夠促進(jìn)性腺中Na+/K+-A

8、TP酶活性。
　　4.甲基法呢酯對中華絨螯蟹性腺中卵黃蛋白原表達(dá)的影響
　　體外培養(yǎng)中華絨螯蟹卵母細(xì)胞。與對照組相比,在培養(yǎng)液中加入10-8mol/L甲基法呢酯能夠有效的促進(jìn)卵黃蛋白原mRNA的表達(dá)(P<0.01)。0.5μmol/L蛋白激酶C激動劑PMA使卵黃蛋白原mRNA表達(dá)量下降(P<0.05)。而0.5nmol/L蛋白激酶C抑制劑Staurosporine能夠卵黃蛋白原 mRNA表達(dá)量上升,但是差異不顯著(P>0.0