甜菜抗叢根病細(xì)胞生物學(xué)特征研究—著重于活性氧代謝及細(xì)胞壁成分的研究.pdf

1、甜菜是我國乃至世界上重要的糖料作物和經(jīng)濟(jì)作物之一，由于長期以來受到甜菜各種病害的襲擊，不僅給甜菜生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且制約制糖業(yè)的發(fā)展。甜菜叢根病(Rhizomania)是危害最為嚴(yán)重的病害之一，該病以多粘菌（Polymyxa betae）為傳播介體，由甜菜壞死黃脈病毒（Beet necroticyellow vein virus，BNYVV）引起的土傳病害。近年來，國內(nèi)外主要從病原基因組學(xué)、分子生物學(xué)及寄主生理生化角度來探討病毒

2、致病機(jī)理和甜菜抗叢根病機(jī)理。本研究以甜菜抗、感叢根病品種與 BNYVV互作體系為研究對象，對不同互作體系中的形態(tài)學(xué)特征和細(xì)胞學(xué)特征進(jìn)行了比較研究，利用生理生化方法明確不同互作體系間活性氧（H2O2和O2-·）及保護(hù)酶系（POD和SOD）產(chǎn)生的時(shí)間變化特征，采用電鏡細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記技術(shù)在亞細(xì)胞水平上對活性氧（H2O2和O2-·）及保護(hù)酶系（POD和SOD）的空間分布進(jìn)行了定位，并檢測了不同互作體系間木質(zhì)素組織定位的差異及細(xì)胞壁糖蛋白在寄主細(xì)胞

3、內(nèi)積累的規(guī)律，以明確活性氧代謝及細(xì)胞壁成分在甜菜抗叢根病性中的作用，從而為進(jìn)一步揭示甜菜抗叢根病信號傳導(dǎo)機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。通過研究取得的主要結(jié)果如下：
　　1.利用光學(xué)顯微技術(shù)和透射電鏡技術(shù)研究了甜菜抗、感叢根病品種與 BNYVV互作過程中的形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明，不同寄主與病毒互作體系的甜菜塊根形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)上均表現(xiàn)出明顯的差異，而甜菜葉脈受該病毒侵染后其形態(tài)學(xué)解剖結(jié)構(gòu)無差異，但超微結(jié)構(gòu)受到影響。形態(tài)學(xué)水平上，抗、感病

4、品種表現(xiàn)為表皮破壞，皮層薄壁細(xì)胞組織產(chǎn)生裂隙，大多細(xì)胞都脫落，木質(zhì)部附近的木薄壁細(xì)胞破損，完全喪失了對根部的保護(hù)作用。其中感病品種比抗病品種表現(xiàn)被傷害程度更為嚴(yán)重，其皮層薄壁細(xì)胞幾乎全部脫落，生長速度緩慢，根部發(fā)育受阻。而葉脈的形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)與對照比較，未發(fā)現(xiàn)異常變化。另外抗病品種比感病品種有更發(fā)達(dá)的維管束結(jié)構(gòu)。在亞細(xì)胞水平上，BNYVV對感病品種的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，整個(gè)細(xì)胞變形，空虛化，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，線粒體和高爾基體明顯增多，

5、細(xì)胞質(zhì)中小液泡增多，在液泡膜邊緣可見到一些纖細(xì)絲狀物質(zhì)的圓形或卵圓形小泡突入液泡中。葉脈細(xì)胞葉綠體完全瓦解，出現(xiàn)許多嗜鋨顆粒。而抗病品種細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞較輕，寄主細(xì)胞產(chǎn)生一系列顯著的結(jié)構(gòu)防衛(wèi)反應(yīng)：形成細(xì)胞壁沉積物及液泡膜上顯示出黑色顆粒狀沉積物等。說明組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞器病理變化與甜菜抗叢根病性有關(guān)。
　　2.利用生理生化方法和電鏡細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記技術(shù)研究了甜菜－BNYVV互作過程中 H2O2和O2-·產(chǎn)生的時(shí)間變化特征和空間分布

6、定位。研究結(jié)果表明，甜菜抗、感叢根病體系均在侵染早期出現(xiàn)大量 H2O2和O2-·，其中抗病體系的H2O2和O2-·產(chǎn)生量明顯高于感病體系。H2O2在抗病和感病體系中的分布位置基本相似，多分布在塊根、葉脈細(xì)胞的液泡膜和質(zhì)膜上，葉脈細(xì)胞間隙也有H2O2的分布，而 O2-·在抗病品種塊根與葉脈細(xì)胞的質(zhì)膜上定位，感病品種的則在液泡膜上被發(fā)現(xiàn)。而且感病體系 H2O2和O2-·沉積量明顯弱于抗病體系。H2O2和O2-·產(chǎn)生量和分布與甜菜抗叢根病性有

7、密切聯(lián)系，不同部位定位的H2O2和O2-·作為信號分子，參與了甜菜對病毒侵染的防御反應(yīng)。
　　3.采用生化檢測及酶細(xì)胞化學(xué)方法研究了甜菜與 BNYVV互作過程中 POD和SOD的活性及其在細(xì)胞內(nèi)分布特征。結(jié)果表明，病毒感染前 POD主要定位在甜菜塊根細(xì)胞細(xì)胞壁及葉脈細(xì)胞線粒體和細(xì)胞間隙，當(dāng)病毒感染后，抗、感病甜菜品種塊根皮層細(xì)胞的細(xì)胞壁、質(zhì)膜和液泡膜上的POD及葉脈薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁、質(zhì)膜、液泡膜、線粒體、細(xì)胞間隙上的POD活性均比

8、其對照顯著升高，抗、感病甜菜品種在 POD分布部位上沒有區(qū)別，但兩者沉積量有所差異，抗病品種明顯高于感病品種；SOD在未感染病毒的抗、感病甜菜塊根皮層薄壁細(xì)胞質(zhì)膜與液泡膜，葉脈厚角組織薄壁細(xì)胞質(zhì)膜及葉脈細(xì)胞線粒體、細(xì)胞間隙上被發(fā)現(xiàn)，病毒侵染后甜菜抗、感病品種塊根 SOD在細(xì)胞內(nèi)分布位置相同都分布在質(zhì)膜和液泡膜，但抗病品種以質(zhì)膜上分布為主，感病品種以液泡膜上分布為主?？共∑贩N SOD活性不僅明顯高于其對照，也明顯高于病毒侵染后的感病品種。

9、甜菜抗、感病品種 POD及 SOD細(xì)胞內(nèi)分布的沉積量與生理生化檢測的酶活性結(jié)果一致，從亞細(xì)胞學(xué)水平說明高活性的POD及 SOD是甜菜抗叢根病性生化標(biāo)記的重要生理機(jī)制之一。
　　4.通過組織化學(xué)染色法及電鏡細(xì)胞化學(xué)方法研究 BNYVV對甜菜細(xì)胞壁中木質(zhì)素和HRGP的影響。結(jié)果顯示，BNYVV侵染前后在甜菜抗、感病品種的塊根與葉脈橫切面的所有導(dǎo)管上均有木質(zhì)素和HRGP的沉積，塊根薄壁組織的細(xì)胞壁由外向內(nèi)也逐漸顯示出由深至淺的木質(zhì)素沉積