牛傳染性鼻氣管炎病毒eE基因表達(dá)與針對(duì)gB基因shRNA抑制IBRV的體外增殖研究.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎(InfectiousBovineRhinotracheitis，IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（InfectiousBovineRhinotracheitisvirus，IBRV）引起的牛的急性、熱性和接觸性傳染病。該病臨床上主要表現(xiàn)為高熱、呼吸困難、鼻炎和上呼吸道炎癥以及母牛流產(chǎn)、死胎等癥狀。目前，在國內(nèi)主要依賴價(jià)格昂貴的試劑盒檢測(cè)IBR，尚缺乏能夠廣泛應(yīng)用的商品化的診斷試劑，所以需要開發(fā)能準(zhǔn)確診斷IBR的產(chǎn)品和治

2、療方法。
　　 gE編碼的糖蛋白屬于一種典型的跨膜糖蛋白，gE糖蛋白的胞外區(qū)暴露在病毒粒子的表面，是動(dòng)物機(jī)體免疫細(xì)胞識(shí)別的靶抗原。本研究第一部分構(gòu)建了牛傳染性鼻氣管炎病毒IBRVgE基因原核重組載體，并將重組蛋白純化后作為包被抗原簡單檢測(cè)了抗原的效價(jià)，所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性，可用于IBRV診斷試劑和亞單位疫苗的研究。
　　 試驗(yàn)依據(jù)IBRV全基因組序列設(shè)計(jì)引物，克隆gE基因，可見約1728bp的特異條帶，測(cè)序鑒定

3、正確后添加酶切位點(diǎn)，酶切連接構(gòu)建原核表達(dá)載體peET32a-gE，并利用www.expasy.org/cgi-bin/protparam、TMHMM在線服務(wù)器、BioEdit、DNAStar等工具對(duì)重組蛋白的氨基酸序列、抗原性、水溶性和表面可及興等基本性質(zhì)進(jìn)行分析。經(jīng)5‰IPTG誘導(dǎo)6h表達(dá)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在。融合蛋白大小約為87，000，與預(yù)測(cè)值相符。利用Ni層析柱純化重組蛋白，并用Wester

4、n-blot鑒定純化的重組蛋白濃度為0.4mg/ml(0.123A)。ELISA檢測(cè)證明純化后的重組蛋白具有良好的免疫原性，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)抗體效價(jià)為1∶3200，為IBRV新鑒定方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　 gB基因是IBRV保守性最高的基因，一般作為PCR鑒定的主要目的片段。gB是病毒復(fù)制的必需因子，也是IBRV刺激宿主免疫應(yīng)答的主要抗原蛋白。因此作為本研究的靶向基因。RNAi技術(shù)是一種新的鑒定基因功能、制造抗病毒藥物的方法。