玉米miR528a對低硝酸鹽等非生物逆境的響應和調控機制.pdf

1、低氮等非生物逆境是農作物生產中產量限制因子。作物非生物逆境的遺傳與生理學基礎研究將為作物抗性品種培育奠定理論與技術基礎。玉米是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物，已成為我國第一大作物。我國玉米主產區(qū)氮肥回收率僅為25.2％，氮肥利用效率低下是我國玉米生產上重要問題，提高玉米氮肥利用效率與培育耐低氮品種是我國農業(yè)可持續(xù)發(fā)展上的重大需求。因此，開展玉米耐低氮遺傳與生理學基礎研究具有重要意義。miRNA通過轉錄后水平調節(jié)參與植物發(fā)育與逆境脅迫適應

2、性，是植物重要的調節(jié)因子。前期研究表明，Zm-miR528a可能參與了低氮逆境下玉米根與葉的適應性調節(jié)，但缺乏明確的實驗證據。木研究擬利用RLM-5’RACE方法鑒定與發(fā)現miR528a的靶基因，分析miR528a與其靶基因對多種非生物逆境的響應與調節(jié)模式，并通過在模式生物系統擬南芥中表達miR528a與靶基因，以分析該基因參與低氮等非生物逆境適應性調節(jié)的機制。本研究將為miR528a及其靶基因在分子育種應用中提供重要理論與實驗基礎。主

3、要研究結果如下：
　　 1.RLM-5'RACE鑒定與發(fā)現了miR528a4個靶基因，分別是GRMZM2G062069T02、GRMZM2G169033T01、GRMZM2G004106T01和ZmLac5。結果表明，miR528a與四個靶基因的剪切作用位置均在編碼區(qū)內，證實miR528a對4個靶基因的調控均發(fā)生在轉錄后水平。除了2069的作用位點在第1位外，其余三個靶基因的作用位點在與成熟miR528a互補的第10或11位堿基

4、處。證實了miR528a通過在特定位點切割靶基因使其mRNA降解，從而調節(jié)該基因的表達。
　　 2.采用In-Fusion試劑盒構建了過表達載體pCUB-Ubi∷ZmLac5，通過電擊法將過表達載體導入根癌農桿菌LBA4404中，并成功轉化擬南芥(ecotypeColumbia)，獲得T1代陽性植株62株，轉化率為1.28％，T2代陽性植株60株。獲得了穩(wěn)定過表達的株系以用于有關功能鑒定與分析。
　　 3.從玉米自交系B

5、73克隆了MIR528a基因，構建過表達載體pCPB-35S∷MIR528a，通過農桿菌介導的轉化方法，將MIR528a基因轉入擬南芥中，并獲得了T1代的轉基因植株，以用于有關功能鑒定與分析。
　　 4.通過定量PCR方法驗證了miR528a及靶基因在8個非生物逆境下的表達模式。結果表明，玉米miR528a響應低氮脅迫：低硝酸鹽脅迫，在葉中，miR528a下調表達，其靶基因9033和ZmLac5上調表達；低銨鹽脅迫，在根和葉中，