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文檔簡(jiǎn)介
1、2006年,我國(guó)豬群中暴發(fā)一種以高熱、腹式呼吸、咳嗽、食欲不振、便秘或腹瀉、眼分泌物增多等為主要癥狀的傳染病。最初對(duì)該病的病因沒有明確定論,故將之定名為“豬無名高熱”或“豬高熱病”。為了研究“豬高熱病”中主要病毒性病原在國(guó)內(nèi)的流行情況,本研究對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查;分析了PRRSV國(guó)內(nèi)流行株與國(guó)內(nèi)外其它毒株間的遺傳演化關(guān)系。在對(duì)病原基因組本身認(rèn)識(shí)加深的基礎(chǔ)上,利用反向遺傳學(xué)手段獲得了一株P(guān)RRSV標(biāo)記毒
2、株株并對(duì)其進(jìn)行了初步免疫實(shí)驗(yàn)研究;進(jìn)一步對(duì)PRRSV活病毒載體疫苗的可行性進(jìn)行了探索。
本研究為我國(guó)豬群中主要病毒病原的分子流行病學(xué)特征提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)也為PRRSV的防控提供了新的思路,奠定了理論基礎(chǔ)。本研究具體內(nèi)容如下:
1、中國(guó)部分地區(qū)豬瘟病毒分子流行病學(xué)調(diào)查
為了研究中國(guó)豬瘟病毒(CSFV)的分子流行病學(xué),本試驗(yàn)用巢式RT-PCR檢測(cè)2008年1月到2011年3月送檢的不同豬場(chǎng)病料,并
3、對(duì)其中103個(gè)CSFV分離株的E2基因序列進(jìn)行分析。進(jìn)化分析結(jié)果表明這些毒株分屬1群的1.1亞群和2群的2.1和2.2亞群,沒有3群毒株存在。2.1亞群毒株為優(yōu)勢(shì)流行毒株,流行范圍覆蓋大陸絕大部分地區(qū)。這些結(jié)果豐富了國(guó)內(nèi)CSFV基因變異情況的數(shù)據(jù),將為新的診斷方法的建立、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)以及有效的防控措施制定提供理論基礎(chǔ)。
2、中國(guó)部分地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子流行病學(xué)調(diào)查
對(duì)來自2006-2010年中國(guó)15
4、個(gè)不同省、自治區(qū)、直轄市的疑似豬繁殖與呼吸合征(PRRS)發(fā)病豬場(chǎng)的送檢病料進(jìn)行豬繁殖與呼吸合征病毒(PRRSV)的檢測(cè),并對(duì)其部分ORF5基因進(jìn)行測(cè)序,以確定當(dāng)前PRRSV在中國(guó)的分子流行病學(xué)特征,并分析PRRSV在中國(guó)的遺傳變異規(guī)律。使用RT-PCR的方法對(duì)采集的樣品進(jìn)行PRRSV檢測(cè),并對(duì)PRRSV檢測(cè)呈陽性的69份病料進(jìn)行ORF5基因的序列測(cè)定和分析。1196份病料中共檢測(cè)到247份陽性樣品,陽性率為20.7%。對(duì)ORF5序列進(jìn)
5、行分析表明,69株P(guān)RRSV毒株序列均屬于2型,與GenBank中高致病性藍(lán)耳?。℉P-PRRSV)參考毒株的氨基酸同源性為94.0%-100%。所測(cè)序列與PRRSV參考株一并,共可分為5個(gè)亞型,亞型Ⅳ與HP-PRRSV遺傳距離最近。同時(shí),進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,69個(gè)毒株在空間分布上存在散在性,來源于不同省市的PRRSV毒株的遺傳關(guān)系存在交叉,病毒分型并沒有呈現(xiàn)明顯的地域性;PRRSV在中國(guó)的流行株為HP-PRRSV,PRRSV在目前中國(guó)
6、的遺傳演進(jìn)相對(duì)穩(wěn)定。
3、PRRSV中國(guó)流行株全基因組序列的測(cè)定與分析
為了進(jìn)一步研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒在國(guó)內(nèi)的遺傳變異情況及分子生物學(xué)特征,本研究在上一章研究的基礎(chǔ)上,對(duì)一株國(guó)內(nèi)分離株JS0922株進(jìn)行了全基因組的序列測(cè)定。根據(jù)ATCC VR-2332標(biāo)準(zhǔn)株和JX143高致病性藍(lán)耳病代表株的序列設(shè)計(jì)引物,對(duì)1株2009年的PRRSV江蘇分離毒株JS0922全基因進(jìn)行了分段擴(kuò)增并測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果拼接后,得
7、到病毒的全基因,然后進(jìn)行序列的比對(duì)分析。分析數(shù)據(jù)顯示,PRRSV JS0922株屬于基因2毒株,它與2006年以前的分離株相比存在明顯差異,與國(guó)內(nèi)早期BJ-4株的核苷酸同源性僅為89%;而與高致病藍(lán)耳病病毒(HP-PRRSV)的同源性較高,達(dá)98%以上。就基因組各開放閱讀框而言,JS0922的ORF3、ORF4基因變異較大,ORF6則較為保守。分析發(fā)現(xiàn),JS0922基因組具有HP-PRRSV的分子特征,但部分位點(diǎn)氨基酸的突變明顯區(qū)別于H
8、P-PRRSV。綜上,JS0922毒株發(fā)生了部分變異,具備了一些新的特點(diǎn),但總體上劃歸于HP-PRRSV演化中的一個(gè)分支,屬于目前國(guó)內(nèi)PRRSV的優(yōu)勢(shì)流行株。
4、豬繁殖與呼吸綜合征病毒結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白N端非必需區(qū)的研究
為了確定豬繁殖與呼吸綜合征病毒nucleocapsid(N)蛋白N末端非重疊區(qū)域的非必需區(qū)的范圍,我們?cè)趩渭儗RRSV ORF6與ORF7重疊區(qū)拉開的背景質(zhì)粒上進(jìn)行了系列研究。本實(shí)驗(yàn)參照骨架
9、質(zhì)粒p7PNX的序列設(shè)計(jì)引物,選取其N蛋白N端從起始密碼子之后的氨基酸進(jìn)行系列缺失,構(gòu)建一系列缺失突變體。通過轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞進(jìn)行病毒拯救,確定在ORF7無重疊區(qū)的情況下,N末端的2-7位氨基酸對(duì)于病毒的感染性是非必需的。對(duì)缺失體盲傳后發(fā)現(xiàn),缺失區(qū)域在體外遺傳性能穩(wěn)定。對(duì)缺失體進(jìn)行多步生長(zhǎng)曲線和空斑實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)缺失體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和空斑形態(tài)學(xué)特征與野生型相似。本研究首次確定了2型PRRSV的N蛋白non-overlapping背景下N末端
10、的缺失區(qū)域,為進(jìn)一步解析N蛋白結(jié)構(gòu)與功能、創(chuàng)制新型基因工程標(biāo)記疫苗奠定了基礎(chǔ)。
5、豬繁殖與呼吸綜合征結(jié)構(gòu)蛋白N蛋白標(biāo)記毒株的構(gòu)建及初步免疫實(shí)驗(yàn)研究
當(dāng)前的PRRSV疫苗對(duì)疫苗免疫豬和自然感染豬上無法提供血清學(xué)鑒別。因此,我們需要利用新的方法制備一種新型的,更為有效的疫苗。利用反向遺傳技術(shù),我們構(gòu)建了一個(gè)基因標(biāo)記毒株—v7APMa,該候選株的核衣殼蛋白與野生毒株(vAPRRS,2型PRRSV)有所差異。v7A
11、PMa在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中顯示了良好的遺傳穩(wěn)定性,并且其基因標(biāo)記的病毒特性在子代病毒中能夠很好的得到復(fù)制。在體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)中,標(biāo)記病毒v7APMa和親本病毒vAPRRS一樣,能夠誘導(dǎo)感染豬產(chǎn)生相當(dāng)水平的抗N蛋白抗體,也能誘導(dǎo)相似滴度的中和抗體。同時(shí),兩組免疫組仔豬血清中的IL-4和IFN-γ的含量也明顯升高。說明標(biāo)記病毒和親本病毒一樣,能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生正常的免疫應(yīng)答。v7APMa感染豬在在感染后14天能夠產(chǎn)生抗基因標(biāo)記特異性多肽的抗體。但是
12、vAPRRS和對(duì)照組在整個(gè)過程未能產(chǎn)生針對(duì)基因標(biāo)記特異性多肽的抗體。說明診斷ELISA方法能夠區(qū)分vAPRRS病毒和標(biāo)記病毒v7APMa。在實(shí)驗(yàn)28天PRRSV強(qiáng)毒株JX143攻毒后,對(duì)照組出現(xiàn)典型的PRRS臨床癥狀,表現(xiàn)為體溫升高、食欲下降,眼瞼水腫,流鼻涕,咳嗽,皮膚發(fā)紅等臨床癥狀,且在攻毒后11天和14天分別有1頭仔豬死亡。而v7APMa和vAPRRS免疫的豬體溫也有體溫升高,但持續(xù)時(shí)間短,臨床癥狀較輕,無豬只死亡。說明vAPRR
13、S和v7APMa均可以對(duì)異源毒株JX143攻毒提供一定的免疫保護(hù)。結(jié)果表明,通過這種新的方法制備出的基因標(biāo)記毒株為PRRSV標(biāo)記疫苗的創(chuàng)制提供了新的思路。
6、豬繁殖與呼吸綜合征病毒活載體疫苗候選株的構(gòu)建及其病毒學(xué)特性的研究
為了獲得以PRRSV作為活病毒載體的疫苗候選株,并探究在PRRSV的ORF4與ORF5之間運(yùn)載外源蛋白基因的可行性,本實(shí)驗(yàn)將(equine arteritis virus,EAV)的OR
14、F4嵌合入PRRSV基因組中,經(jīng)PCR、酶切和基因測(cè)序鑒定,篩選獲得陽性重組質(zhì)粒pAPRRS(EAV4)。轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BHK-21細(xì)胞,拯救獲得了重組嵌合病毒vAPRRS(EAV4)。經(jīng)MARC-145連續(xù)傳代,證明其基因組在體外可以穩(wěn)定遺傳。Northern-blot、亞基因組測(cè)序和間接免疫熒光表明,PRRSV自身基因組可完成復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯各過程,但嵌合入的EAV的ORF4沒有轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。對(duì)嵌合體進(jìn)行多步生長(zhǎng)曲線和空斑實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)
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