柑桔抗Alternaria alternata遺傳分析及QTL定位.pdf

1、由交鏈格孢菌(Alternaria alternata)引起的柑桔褐斑病是一種可同時(shí)危害柑桔嫩葉、嫩梢及幼果的病害。近幾年在我國(guó)各大柑桔產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，且發(fā)病面積不斷擴(kuò)大，導(dǎo)致柑桔的產(chǎn)量和品質(zhì)下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　目前，國(guó)內(nèi)不同柑桔品種對(duì)褐斑病的抗性未見相關(guān)報(bào)道，與之相關(guān)的抗褐斑病基因認(rèn)知不足，且缺乏快速穩(wěn)定的致病力評(píng)價(jià)體系，進(jìn)而影響病害的防治研究和實(shí)踐。建立穩(wěn)定的致病力評(píng)價(jià)體系，篩選出抗柑桔褐斑病品種，為生產(chǎn)防治和挑選經(jīng)

2、濟(jì)適用品種提供參考;定位相關(guān)的抗性基因，從育種上根本解決這一問(wèn)題成為當(dāng)務(wù)之急。
　　本研究采用室內(nèi)接菌餅的方法建立一個(gè)快速穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便的菌株致病力評(píng)價(jià)體系。并應(yīng)用該體系對(duì)重慶4大主栽品種中的54個(gè)不同柑桔品種進(jìn)行抗病性分析，采用不同評(píng)價(jià)方法進(jìn)行抗性等級(jí)劃分，明確不同柑桔品種對(duì)褐斑病的抗性。另外，以實(shí)驗(yàn)室已建立的柑桔分子標(biāo)記遺傳圖譜為基礎(chǔ)，利用“梨橙2號(hào)×晚蜜2號(hào)”及所得到的68株F1代為材料，以嚴(yán)重度（病斑直徑大?。┖桶l(fā)病率為指

3、標(biāo)，通過(guò)QTL定位到相應(yīng)的標(biāo)記位點(diǎn)。采用qPCR對(duì)部分標(biāo)記基因進(jìn)行分析。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)從萬(wàn)州紅桔上采集柑桔褐斑病受害樣本，在室內(nèi)進(jìn)行分離純化和鑒定。研究發(fā)現(xiàn)菌落、菌絲、分生孢子形態(tài)特征與鏈格孢菌相似;接種致病產(chǎn)生黃色暈圈;以ITS1和ITS4為引物，擴(kuò)增得到532bp的ITS區(qū)DNA片段。將測(cè)序結(jié)果登錄GenBank進(jìn)行BLAST比較，與A.alternata的相似性達(dá)到99％，以PG2和PG3(endoPG)區(qū)系

4、列引物擴(kuò)增序列構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)分離株與A.alternata聚為一枝。
　　(2)首次在“溫州蜜柑”離體葉片和果實(shí)上造成不同傷口處理，接種強(qiáng)致病菌株A.alternata HJX，25℃保濕培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)葉片不接菌對(duì)照有、無(wú)傷口均不發(fā)病;其余各種傷口處理均發(fā)病，不同傷口類型對(duì)病害影響很大。葉片反面較正面更易于發(fā)病，反面10針、1針及無(wú)傷接種發(fā)病無(wú)明顯差異;果實(shí)表面1針、10針及去除果皮對(duì)發(fā)病影響達(dá)到極顯著水平。用6個(gè)不同柑桔品種及Alt

5、ernaria cirri ZYF，Alternaria sp.MP32個(gè)菌株驗(yàn)證方法的穩(wěn)定性及可靠性，發(fā)現(xiàn)菌株HJX在不同品種上致病力存在差異，2個(gè)菌株之間的致病力也存在差異。建議以離體柑桔葉片或果實(shí)為材料，葉片反面1針接種或果實(shí)去皮接種，25℃保濕培養(yǎng)2d后調(diào)查病斑大小，作為室內(nèi)準(zhǔn)確、快速評(píng)價(jià)柑桔褐斑病致病力的方法。
　　(3)評(píng)價(jià)54個(gè)柑桔品種對(duì)褐斑病菌的感病程度及抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。采用室內(nèi)人工接種觀察不同品種的感病程度并根據(jù)系

6、統(tǒng)聚類法、平均直徑法、病情指數(shù)法3種不同抗性評(píng)價(jià)方法來(lái)探討54個(gè)柑桔品種對(duì)柑桔褐斑病菌的抗性。結(jié)果表明:參試的種質(zhì)資源共分為高抗、抗病、中抗、感病、高感五類，未發(fā)現(xiàn)免疫種質(zhì);胡柚、強(qiáng)德勒、華盛頓臍橙和梁平柚4個(gè)品種為高抗品種;大多數(shù)寬皮柑類品種易感病。本研究本研究為指導(dǎo)田間栽培和抗柑桔褐斑病菌育種提供理論依據(jù)。
　　(4)利用“梨橙2號(hào)×晚蜜2號(hào)”及衍生的68個(gè)LW重組自交系為材料，采用室內(nèi)離體葉片接菌餅的方法，對(duì)其進(jìn)行抗病性分析

7、。并在已構(gòu)建的含有334個(gè)SSR標(biāo)記，9個(gè)連鎖群，總長(zhǎng)844.2cM，平均圖距2.53cM的分子遺傳圖譜基礎(chǔ)上，運(yùn)用Map QTL5.0分析軟件，采用區(qū)間作圖(Interval Mapping)進(jìn)行QTL初步檢測(cè)，再利用多重區(qū)間作圖法(MQM)進(jìn)行優(yōu)化，共檢測(cè)到18個(gè)與柑桔識(shí)別抗性相關(guān)的標(biāo)記，分布在LW2和LW3上，其中在LW2上檢測(cè)到11個(gè)QTL位點(diǎn)，名為qlt2.1、qlt2.2、qlt2.3、qlt2.4、qlt2.5、qlt2.

8、6、qlt2.7、qlt2.8、qlt2.9、qlt2.10、qlt2.11，貢獻(xiàn)率分別為23.9％、23.2％、21.2％、20.4％、20.4％、20.2％、17.8％、17.8％、17.4％、17.3％、15.8％;LW3上檢測(cè)到7個(gè)QTL位點(diǎn)，名為qlt3.1、qlt3.2、qlt3.2、qlt3.4、qlt3.5、qlt3.6、qlt3.7貢獻(xiàn)率分別為25％、18.4％、18.2％、17.9％、16.7％、16.6％、16.4

9、％。共檢測(cè)到8個(gè)與柑桔防御抗性相關(guān)的QTL位點(diǎn)，其中在LW1上檢測(cè)到2個(gè)位點(diǎn)，名為qlty1.1、qlty1.2，貢獻(xiàn)率分別為18.2％和15.8％; LW2上為qlty2.1和qlty2.2，貢獻(xiàn)率都為17％，qlty2.3貢獻(xiàn)率為16.3％; LW3上是qlty3.1、qlty3.2貢獻(xiàn)率分別為18.2％和17.4％; LW6上為qlty6.1貢獻(xiàn)率為17.5％。合理利用與這些位點(diǎn)緊密連鎖的固定標(biāo)記cBSSR835E2、CMS30、

10、Hcx4040、cSSR340、F13、cSSR202、 F23、cSSR309、cBDM83E1、cBMM74、cSSR128、cSSR27、cSSR32、HCX6020、CMS14、Hcx6026、F88、LcSSR115對(duì)應(yīng)的EST編碼序列可促進(jìn)抗柑桔褐斑病的分子標(biāo)記輔助育種的發(fā)展。
　　(5)選用中抗品種不知火葉片接種HJX對(duì)QTL標(biāo)記LcSSR115、HCX6020、cSSR309、cSSR202、F88、cSSR340