華中地區(qū)豬源與牛源腸出血性大腸桿菌分離鑒定及生物學(xué)特性研究.pdf

1、腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic Escheri chiacoli，EHEC)是產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shiga-toxinproducingEscherichiacoli，STEC)的一類亞群，1982年被證實(shí)是一種重要的人畜共患病原菌，可以引起人不同程度腹瀉、出血性結(jié)腸炎(Hemorrhagiccolitis，HC)，溶血性尿毒綜合癥(Haemolyticuraemicsyndrome，HUS)等，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡

2、。其代表血清型為O157∶H7，其它非O157EHEC血清型主要包括O26、O111、O103、O121、O45、O145、O104、O91等。本研究通過(guò)PCR方法結(jié)合頭孢克肟-亞碲酸鉀山梨醇麥康凱瓊脂(Cefixime-potassium tellurite Sorbitol Mac Conkey,CT-SMAC)平板分離法對(duì)采集的樣本進(jìn)行EHEC的分離與鑒定，并對(duì)分離菌株進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)特性研究，分析分離菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，以及與國(guó)際

3、上流行的EHEC之間的親緣關(guān)系。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.腸出血性大腸桿菌的分離與鑒定
　　運(yùn)用PCR方法檢測(cè)樣本中EHEC的兩個(gè)主要毒力基因stx1/stx2，結(jié)合CT-SMAC平板分離法對(duì)2011-2013年華中地區(qū)1477份樣本（豬腸道內(nèi)容物432份，豬糞便480份，牛糞便397份，牛奶99份，奶牛場(chǎng)環(huán)境中的水樣69份）進(jìn)行EHEC的分離，并通過(guò)革蘭氏染色、生化鑒定、血清型鑒定、16SrRNA基因鑒定等方法對(duì)分離菌株

4、進(jìn)行鑒定。共分離到EHEC93株，占分離樣本總數(shù)的6.30％(93/1477)，其中豬源EHEC53株，占豬源分離樣本總數(shù)的5.80％(53/912)，牛源EHEC40株，占牛源分離樣本總數(shù)的7.1％(40/565)。93株EHEC涵蓋了28種血清型，以O(shè)157、O26、O91、O100、O97、O92為主要血清型。
　　2.腸出血性大腸桿菌生物學(xué)特性研究
　　對(duì)93株EHEC的溶血特性、致Vero細(xì)胞毒性、藥物敏感性分析研

5、究表明，8株豬源EHEC，5株牛源EHEC對(duì)5％脫纖維綿羊血紅細(xì)胞有溶血現(xiàn)象。91株攜帶有stx1和/或stx2基因的EHEC都能使Vero細(xì)胞產(chǎn)生病變，其余2株EHEC沒有攜帶stx1/stx2基因不能使Vero細(xì)胞產(chǎn)生病變。40株牛源EHEC對(duì)諾氟沙星的敏感率最高，達(dá)到97.5％。對(duì)阿莫西林、氨芐西林、先鋒霉素Ⅳ、先鋒霉素Ⅵ、卡那霉素、頭孢噻肟的敏感率都在20％以內(nèi)，基本不敏感。53株豬源EHEC對(duì)氧氟沙星的敏感率最高，達(dá)到88.7

6、％，對(duì)阿莫西林、氨芐西林、磺胺異惡唑、鏈霉素、慶大霉素、四環(huán)素、新霉素、復(fù)方新諾明、卡那霉素、紅霉素這10種藥物完全耐藥。EHEC分離株對(duì)小鼠致病性研究表明，6株受試代表菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株EDL933(O157∶H7)感染后，死亡率有一定差異，出現(xiàn)臨床癥狀的小鼠各組織器官主要病變?yōu)樾∧c（尤其是十二指）積液，局部腸粘膜水腫、充血、出血;盲腸、結(jié)腸水腫;心臟、脾臟無(wú)明顯病理變化，肝臟、腎臟均有腫大出血;肺膨大。小鼠各組織器官活菌濃度可達(dá)到108

7、CFU/g左右，以盲腸、結(jié)腸活菌濃度最高，其它臟器帶菌量相對(duì)較少。
　　3.腸出血性大腸桿菌多位點(diǎn)序列分型及遺傳進(jìn)化分析
　　根據(jù)大腸桿菌mlst.ucc.ie數(shù)據(jù)庫(kù)提供的多位點(diǎn)序列分型(MultilocusSequenceTyping，MLST)方案，對(duì)93株分離菌株7個(gè)管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行雙向測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在大腸桿菌mlst.ucc.ie數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，從而確定每株菌的序列型。利用MEG