黃瓜CsNR基因的克隆、遺傳轉(zhuǎn)化及在硝酸鹽脅迫下的功能分析.pdf

1、黃瓜（Cucumis sativus L.）是我國設(shè)施和露地主要種植的蔬菜作物之一，土壤次生鹽漬化已成為影響設(shè)施黃瓜生產(chǎn)的主要障礙之一，NO3-是土壤次生鹽漬化的的主要陰離子。植物通過硝酸鹽同化途徑以NO3-和NH4+的形式吸收N。硝酸鹽的同化是一個受到嚴(yán)格調(diào)控的過程，其中NR和NiR對初級氮的同化起主要調(diào)控作用。NR是整個硝態(tài)氮同化過程的關(guān)鍵酶、限速酶，在植物氮素代謝過程中起關(guān)鍵作用。NR也是植物體內(nèi)的NO合成酶，NO在一定程度上可提

2、高植物的抗逆能力，緩解逆境脅迫。因此探討黃瓜硝酸還原酶基因（CsNR）對NO3-脅迫下植株幼苗抗氧化體系及氮代謝的影響，對指導(dǎo)黃瓜可持續(xù)生產(chǎn)具有重要的理論和現(xiàn)實意義。
　　本試驗通過構(gòu)建 CsNR正義和反義表達(dá)載體，并進行黃瓜和煙草的轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)CsNR（+）和CsNR（-）基因的煙草植株，研究了NR在NO3-脅迫下植株的抗氧化系統(tǒng)、氮代謝相關(guān)酶表達(dá)特性及其內(nèi)源NO的分子調(diào)控機理的影響作用。主要研究結(jié)果如下：
　　1.根據(jù)G

3、eneBank中已發(fā)表的黃瓜CsNR序列（登錄號為NM_001280767）設(shè)計引物進行RT-PCR，將PCR產(chǎn)物回收獲得長度為2748bp的CDS全長與360 bp的反義片段，分別構(gòu)建了CsNR正義和反義表達(dá)載體。同時，黃瓜CsNR基因的氨基酸序列與甜瓜、煙草、擬南芥、油菜NR基因編碼的氨基酸序列高度同源，其中與甜瓜NR蛋白之間同源性最高，達(dá)到98.25％，與煙草NR蛋白的同源性達(dá)到78.67%，黃瓜CsNR反義片段與煙草NR基因編碼

4、的氨基酸序列的同源性達(dá)到90.83%。
　　2.本研究同時通過子房注射法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)途徑進行CsNR基因的遺傳轉(zhuǎn)化。PCR鑒定結(jié)果表明，利用子房注射與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在黃瓜上的遺傳轉(zhuǎn)化未成功，利用農(nóng)桿菌侵染法成功轉(zhuǎn)入煙草中，T0代轉(zhuǎn)基因煙草通過PCR檢測表明其目的基因已成功轉(zhuǎn)入再生植株體內(nèi)，其轉(zhuǎn)化成功率高達(dá)92%。
　　3.研究了硝酸鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因煙草幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)NO3-脅迫降低了POD和CAT的活性，使得H2O2

5、累積，從而對植株造成了傷害。與野生型相比較， CsNR（+）煙草的CAT活性保持較高水平，能夠參與清除H2O2，保護植物不被傷害。CsNR（-）基因植株的SOD、GR活性上升幅度較大，減少植物在逆境脅迫下產(chǎn)生的生理傷害。表明CsNR轉(zhuǎn)基因煙草通過提高煙草抗氧化酶活性來緩解NO3-脅迫。
　　4.研究了硝酸鹽脅迫對轉(zhuǎn)基因煙草氮代謝的影響，發(fā)現(xiàn)NO3-脅迫下，CsNR（+）煙草可提高NR、NiR、GOGAT、GS、GDH活性以及其基因