中紅側(cè)溝繭蜂嗅覺受體基因的克隆和組織表達(dá)譜分析.pdf

1、昆蟲在自然界中搜尋寄主植物主要是通過識(shí)別各種植物的氣味揮發(fā)物來定位，而各種氣味的識(shí)別主要依賴嗅覺器官。嗅覺在昆蟲的多種行為中起至關(guān)重要的作用，例如搜尋寄主、躲避天敵、交配和轉(zhuǎn)移。在嗅覺系統(tǒng)中，氣味受體承擔(dān)著連接外界氣味刺激和嗅覺神經(jīng)的不可或缺的作用。
　　中紅側(cè)溝繭蜂(Microplitis mediator)是一種寄主廣泛的獨(dú)居性的內(nèi)寄生蜂，其寄主涉及鱗翅目40多種昆蟲，其中包括棉鈴蟲、粘蟲、甘藍(lán)夜蛾等重大農(nóng)業(yè)害蟲，中紅側(cè)溝繭蜂

2、是這些害蟲田間生物防控的重要因子。通過分子生物學(xué)的手段研究嗅覺的分子機(jī)制已成為近年來研究熱點(diǎn)，可以為害蟲防治和天敵利用提供新的策略和方法。
　　一、中紅側(cè)溝繭蜂觸角cDNA文庫的構(gòu)建
　　為了明確中紅側(cè)溝繭蜂嗅覺系統(tǒng)的特性，本研究利用SMART技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)高質(zhì)量的中紅側(cè)溝繭蜂的觸角cDNA文庫，通過對(duì)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的高通量測(cè)序，獲得了4785個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽序列。通過BLASTx和BLASTn對(duì)序列進(jìn)行同源性搜索，獲

3、得到一系列的與嗅覺有關(guān)的基因，包擴(kuò)25個(gè)氣味受體的片段。
　　二、中紅側(cè)溝繭蜂嗅覺受體的克隆和分析
　　選取其中13個(gè)氣味受體的片段，通過快速擴(kuò)增cDNA末端的技術(shù)(RACE)獲得這13個(gè)典型性氣味受體基因的全長，利用生物信息學(xué)的方法對(duì)基因序列進(jìn)行了分析。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，雖然克隆的13個(gè)Ors彼此之間及與其他昆蟲的同源性比較低，但仍發(fā)現(xiàn)一些保守位點(diǎn)(G-W-K-Y-H-F-C-W)。對(duì)ORs跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析顯示，ORs具有7

4、個(gè)跨膜區(qū)，N末端位于細(xì)胞膜內(nèi)，C末端位于細(xì)胞膜外。
　　三、中紅側(cè)溝繭蜂嗅覺受體的組織表達(dá)譜分析
　　通過熒光定量PCR(real time PCR)對(duì)13個(gè)ORs和非典型性嗅覺受體ORco的組織表達(dá)譜進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，不同嗅覺受體在不同組織和雌雄蟲中表達(dá)量差異很大，但在觸角均高表達(dá)。其中3個(gè)嗅覺受體(MmedOr2，MmedOr12和MmedOr13)在雌蟲觸角高表達(dá)，8個(gè)嗅覺受體(MmedOrco，MmedOr3，Mm

5、edOr4，MmedOr5，MmedOr7，MmedOr8，MmedOr9和MmedOr11)在雄蟲觸角高表達(dá)，其中3個(gè)嗅覺受體(MmedOr1，MmedOr6和MmedOr10)在雌雄蟲觸角中表達(dá)量比較接近。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，MmedOr6和MmedOr8在足中有相對(duì)較高的表達(dá)量，MmedOr10和MmedOr11在頭部（去除觸角）有相對(duì)較高的表達(dá)量。
　　針對(duì)在雌蟲觸角中高表達(dá)的MmedOr2，通過定量PCR法技術(shù)分析其在不同時(shí)期以及

6、交配前后的表達(dá)量變化。該基因在觸角中特異性表達(dá)，雌蜂觸角的表達(dá)量約為雄蜂觸角的5.3倍。在預(yù)蛹期、蛹前期該基因均不表達(dá)，在觸角初始形成時(shí)開始表達(dá)，但一直處于低水平狀態(tài)。MmedOr2的表達(dá)量有一個(gè)迸發(fā)期，雌蜂發(fā)生在羽化后第3天，雄蜂發(fā)生在羽化后第2天，迸發(fā)期時(shí)雌蜂觸角的表達(dá)量約為雄蜂觸角表達(dá)量的8.7倍。迸發(fā)期后雌蜂觸角該基因表達(dá)量顯著下降;雄蜂觸角的表達(dá)量一直處于平穩(wěn)上升狀態(tài)至第4天出現(xiàn)表達(dá)量高峰，之后表達(dá)量穩(wěn)步下降。另外，雌蜂交配后