利用表面等離子共振生物傳感器檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒和crylF蛋白的研究.pdf

1、隨著全球化貿(mào)易的發(fā)展以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用，我國(guó)近年來在玉米相關(guān)領(lǐng)域的國(guó)際貿(mào)易越來越頻繁，導(dǎo)致玉米褪綠斑駁病毒等檢疫性有害生物以及轉(zhuǎn)基因蛋白隨玉米種子傳入的風(fēng)險(xiǎn)也越來越大。因此如何簡(jiǎn)便快捷地檢測(cè)出進(jìn)口玉米中的檢疫性病毒以及其他產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因蛋白具有重要的意義。本課題利用SPR生物傳感器，對(duì)玉米褪綠斑駁病毒和轉(zhuǎn)基因抗蟲蛋白cry1F的檢測(cè)進(jìn)行了研究。
　　 本課題包括三個(gè)部分。首先以健康玉米葉為原材料，對(duì)玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)

2、進(jìn)行了繁殖和純化，然后經(jīng)小鼠免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞篩選與克隆以及腹水抗體制備與純化過程獲得了純化的玉米褪綠斑駁病毒單克隆抗體，并對(duì)其進(jìn)行了效價(jià)測(cè)定、亞類鑒定、特異性分析以及靈敏度研究。然后，基于表面等離子共振生物傳感器檢測(cè)方法，對(duì)純化的玉米褪綠斑駁病毒的檢測(cè)進(jìn)行了研究。優(yōu)化了相關(guān)檢測(cè)條件，對(duì)病毒檢測(cè)的靈敏度和特異性進(jìn)行了研究;并且在優(yōu)化條件下對(duì)攜帶玉米褪綠斑駁病毒的實(shí)際玉米樣品的檢測(cè)進(jìn)行了研究。最后，利用SPR生物傳感器對(duì)Bt抗蟲蛋

3、白cry1F的檢測(cè)進(jìn)行了研究。
　　 主要研究成果如下:
　　 (1)獲得了純化的玉米褪綠斑駁病毒，濃度為10mg/mL。獲得了1株命名為1C5能穩(wěn)定分泌抗MCMV的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，效價(jià)為1×106，IgG1亞類，經(jīng)G蛋白柱純化的單克隆抗體的濃度為0.46mg/mL。該單抗特異性很好，能檢測(cè)攜帶玉米褪綠斑駁病毒的玉米病汁液的最大稀釋倍數(shù)為6400倍。
　　 (2)建立了檢測(cè)MCMV的SPR方法。確立了檢

4、測(cè)MCMV的最優(yōu)條件:SPR芯片抗體固定時(shí)間3h、抗體固定濃度200μ g/mL、抗體固定溫度37℃、抗體固定pH6、進(jìn)樣流速10μ1/min、檢測(cè)溫度20℃、檢測(cè)pH7.4。該檢測(cè)方法具有很好的特異性，重復(fù)性較好，最低檢測(cè)限為1ng/mL，并且能夠檢測(cè)實(shí)際帶病玉米樣品，檢測(cè)時(shí)間15min。
　　 (3)建立了檢測(cè)cry1F蛋白的SPR方法，進(jìn)行的特異性和靈敏度實(shí)驗(yàn)表明該方法具有很好的特異性，重復(fù)性好，檢測(cè)靈敏度為10ng/mL