鉀素營養(yǎng)對當歸阿魏酸生物合成相關基因表達的影響.pdf

1、目的：當歸為臨床常用藥，阿魏酸是鑒別當歸質(zhì)量優(yōu)劣的主要指示性指標之一。鉀素是植物體內(nèi)60多種酶的活化劑，鉀素的適量施用對作物的生長、產(chǎn)量及品質(zhì)等均有積極影響。多年來，國內(nèi)外關于當歸資源評價、生理特性、栽培育種、藥理藥化以及活性成分的分離提取等方面的研究已有大量報道，但基于與活性成分合成相關的功能基因的分子生物學和營養(yǎng)調(diào)控的研究，國內(nèi)外還鮮有報道。本研究旨在通過對當歸阿魏酸生物合成中重要基因咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(COMT)、4-香豆

2、酸輔酶A連接酶基因(4CL)和阿魏酸-5-羥基化酶基因(F5H)的克隆和表達進行初步分析，并進行鉀素營養(yǎng)調(diào)控，為探索當歸阿魏酸生物合成途徑的分子機制和營養(yǎng)調(diào)控效應奠定基礎，為闡述當歸品質(zhì)形成的營養(yǎng)調(diào)控機制提供理論依據(jù)。
　　方法：參考Genbank已發(fā)表的植物COMT、4CL、F5H基因保守序列設計一對簡并引物，以當歸葉片總 RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法克隆出COMT、4CL和F5H基因核心片段后測序；以核心片

3、段序列設計基因特異性引物，利用cDNA末端快速擴增(RACE)法克隆出COMT和F5H基因兩翼序列；將核心序列和兩翼序列進行電子拼接，設計基因全長擴增引物，擴增出全長
　　cDNA序列，并進行測序，在Genbank中注冊。運用SYBR Green熒光定量PCR方法，以當歸18S基因為內(nèi)參照基因，檢測COMT、4CL和F5H基因在當歸不同組織，不同時期和不同鉀素處理中的表達量。
　　結(jié)果：(1)當歸咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(

4、COMT)全長的克隆及序列分析(登錄號:KP188587):利用RT-PCR和RACE技術，得到了當歸咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因(COMT)全長，該基因cDNA序列長度為1436 bp，含有1個1098 bp的完整開放閱讀框，編碼365個氨基酸。與 NCBI核酸和蛋白數(shù)據(jù)庫中其他7種COMT基因的序列進行比對，結(jié)果序列相似性較高(75％以上)。
　　(2)當歸4-香豆酸輔酶A連接酶基因(4CL)核心片段的克隆及序列分析:利用RT-

5、PCR技術，得到了當歸4-香豆酸輔酶A連接酶基因(4CL)核心片段，該基因片段cDNA序列長度為514 bp，編碼170個氨基酸。與 NCBI核酸和蛋白數(shù)據(jù)庫中其他7種4CL基因的序列進行比對，結(jié)果顯示序列相似性較高(79%以上)。
　　(3)當歸阿魏酸-5-羥基化酶基因(F5H)全長的克隆及序列分析(登錄號:KP257433):利用RT-PCR和RACE技術，得到了當歸阿魏酸-5-羥基化酶基因(F5H)全長，該基因cDNA序列長

6、度為1839 bp，含有1個1539 bp的完整開放閱讀框，編碼512個氨基酸。與 NCBI核酸和蛋白數(shù)據(jù)庫中其他7種F5H基因的序列進行比對，結(jié)果顯示序列相似性較高(70%以上)。
　　(4)不同鉀素水平對COMT、4CL和F5H基因表達的影響:熒光定量PCR結(jié)果表明三個基因隨著時間的延長相對表達量均逐漸增高。COMT基因在前期根系表達量高于莖葉，但后期莖葉相對表達量增高并超過根系；在莖葉和根系中0 mmol/L K+處理對CO

7、MT的表達均有顯著地抑制作用。4CL基因在前期根系表達量高于莖葉，但后期莖葉相對表達量增高并超過根系；且在莖葉中0 mmol/L K+處理和12.0 mmol/L K+處理均會抑制這種基因的表達。F5H基因在莖葉的表達量要顯著高于根系表達量；在莖葉中，前期0 mmol/L K+處理和12.0 mmol/L K+處理均對F5H的表達表現(xiàn)出一定的抑制性，后期12.0 mmol/L K+處理的抑制性降低，但0 mmol/L K+處理仍表現(xiàn)出顯

8、著地抑制性，在根系中，12.0 mmol/L K+處理對F5H的表達表現(xiàn)出顯著地抑制性。
　　結(jié)論：(1)成功克隆出了當歸COMT基因、F5H基因的全長以及4CL基因的核心片段，并在Genbank中注冊，當歸COMT全基因的登錄號為KP188587，當歸F5H全基因的登錄號為KP257433；(2)通過研究鉀素水平對當歸阿魏酸生物合成相關基因表達的影響表明，6.0 mmol/L K+處理無論在當歸幼苗莖葉中還是在根系中均會對當歸C