海水多營養(yǎng)層次生態(tài)養(yǎng)殖池塘細菌群落分析及與環(huán)境因子相關(guān)性研究.pdf

1、本論文針對日前多營養(yǎng)層次養(yǎng)殖池塘微生物作用研究的熱點問題，將微生物分子生態(tài)學(xué)PCR-DGGE技術(shù)引入到我國北方海水多營養(yǎng)層次養(yǎng)殖池塘微生物生態(tài)學(xué)的研究中，優(yōu)化了提取養(yǎng)殖池塘底泥基因組DNA及變性梯度凝膠電泳的條件，同時運用平板計數(shù)法對三個不同養(yǎng)殖模式的對蝦養(yǎng)殖池塘沉積物的細菌數(shù)量及細菌群落多樣性隨養(yǎng)殖周期的動態(tài)變化進行了研究，分析了細菌多樣性在時間和空間上的變化規(guī)律，為養(yǎng)殖區(qū)生態(tài)平衡的維持提供依據(jù)。同時對池塘沉積物DGGE圖譜的顯著條帶

2、進行克隆測序，獲得養(yǎng)殖池塘優(yōu)勢微生物的基因信息，為從原生環(huán)境分離篩選有益功能微生物奠定了基礎(chǔ)。運用統(tǒng)計學(xué)方法，將海水多營養(yǎng)層次養(yǎng)殖池塘沉積物細菌數(shù)量和菌群結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相互作用關(guān)系進行了初步探討，為預(yù)測養(yǎng)殖環(huán)境微生物結(jié)構(gòu)的變化提供參考。主要研究結(jié)果如下：
　　1.PCR-DGGE檢測條件的優(yōu)化
　　從環(huán)境樣品DNA提取方法和PCR擴增條件等方面，探討了DGGE圖譜的優(yōu)化條件，優(yōu)化結(jié)果如下：確定了CTAB的提取DNA方法，可

3、以得到高產(chǎn)率、完整清晰的主帶。以此DNA為模板，引物GC-F341/R534的降落PCR反應(yīng)條件進行擴增。變性梯度凝膠電泳最優(yōu)變性劑濃度梯度范圍為45％-55%，電壓為60v，電泳時間10h，采用銀染染色方法，優(yōu)化后的條件能得到最佳分辨率的DGGE圖譜，條帶分辨清晰。
　　2.多營養(yǎng)層次養(yǎng)殖池塘沉積物細菌群落的結(jié)構(gòu)變化
　　通過對不同養(yǎng)殖模式池塘底泥的DGGE分析，運用凝膠分析軟件分析了DGGE電泳圖譜，結(jié)果如下：
　

4、?。?）三個養(yǎng)殖池塘共計27個樣品中，樣品條帶數(shù)豐富，總共發(fā)現(xiàn)46條不同位置的DGGE條帶。每個樣品的條帶數(shù)在14-33條之間，條帶的含量在不同養(yǎng)殖時期有大幅度的變化，條帶的分布模式也有較大差異。比較三個池塘的樣品，結(jié)果顯示不同樣品條帶數(shù)穩(wěn)定，平均45%為特異性條帶，55%的條帶在各樣品中普遍存在。這說明不同養(yǎng)殖模式池塘的底泥中含有一部分相同的菌群結(jié)構(gòu)，也存在各自的特異性菌群，海水多營養(yǎng)層次養(yǎng)殖池塘中細菌種類繁多，隨養(yǎng)殖時間的推移菌群含

5、量和結(jié)構(gòu)上都有很大變化，不同樣品間存在差異。
　?。?）對各養(yǎng)殖時期的DGGE圖譜做了聚類分析，UPGMA分析圖反映了微生物群落結(jié)構(gòu)隨養(yǎng)殖周期發(fā)生規(guī)律性變化。通過計算Shannon-Wiener多樣性指數(shù)反映不同樣品的菌群多樣性隨時空變化的規(guī)律。本研究中所得的Shannon-Wiener指數(shù)處于較高水平，這說明多營養(yǎng)層次養(yǎng)殖池塘沉積物樣品多樣性非常高。從空間上看相比較其它兩個養(yǎng)殖池塘蝦蟹貝混養(yǎng)的Shannon-Wiener指數(shù)較高

6、且變化幅度不大，說明蝦蟹貝混養(yǎng)模式的微生物群落多樣性高且群落穩(wěn)定性高。從時間上看，在養(yǎng)殖中期各養(yǎng)殖池塘的微生物群落多樣性最高。
　?。?）通過結(jié)合測序結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析表明，海水多營養(yǎng)層次池塘沉積物所得的細菌主要分為8個類群，包括厚壁菌門、變性菌門（有α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、ε-變形菌綱和δ-變形菌綱）、擬桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、藍細菌、綠菌門、酸桿菌門。以上微生物種群大部分是在空間和時間上分布均勻的群落，也

7、有不同營養(yǎng)層次養(yǎng)殖池塘獨有的細菌種群：放線菌門、綠彎菌門是蝦蟹貝養(yǎng)殖池塘的獨有優(yōu)勢種群，均在養(yǎng)殖中期出現(xiàn)并占據(jù)優(yōu)勢；厚壁菌門是蝦蟹養(yǎng)殖池塘的獨有菌群，但僅在養(yǎng)殖中期出現(xiàn)，綠菌門僅在蝦蟹養(yǎng)殖后期出現(xiàn)過；酸桿菌門是對蝦單養(yǎng)池塘的獨有菌群，在養(yǎng)殖前期出現(xiàn)后逐漸衰退消失。藍細菌在蝦蟹和蝦蟹貝養(yǎng)殖池塘后期均有發(fā)現(xiàn)。
　　3.養(yǎng)殖池塘細菌變動與理化因子相關(guān)性分析
　　通過對養(yǎng)殖周期內(nèi)理化指標(biāo)和細菌數(shù)量的動態(tài)監(jiān)測，結(jié)果表明養(yǎng)殖過程中各理化

8、因子變化范圍均在養(yǎng)殖對蝦的耐受范圍之內(nèi)。不同養(yǎng)殖池塘底泥中異養(yǎng)菌總數(shù)和弧菌總數(shù)隨養(yǎng)殖時間的增加而發(fā)生變化，其中弧菌數(shù)量的波動較異養(yǎng)菌總數(shù)要大，這可能是由于底泥中弧菌數(shù)量對理化因子的波動更為敏感。相關(guān)性分析表明，養(yǎng)殖池塘的底泥細菌總數(shù)與有機質(zhì)的含量呈正相關(guān)，水體氮營養(yǎng)鹽含量、溫度均影響底泥細菌數(shù)量的變動，而弧菌的數(shù)量與各理化指標(biāo)的變動無顯著性關(guān)聯(lián)。對微生物群落的變動與養(yǎng)殖環(huán)境理化因子做了典型性對應(yīng)分析，由結(jié)果可知本研究中檢測的理化包涵了與