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文檔簡介
1、小麥赤霉病是由鐮刀菌引起的一種世界性的真菌病害,主要在濕潤和半濕潤地區(qū)發(fā)生。有17種鐮刀菌可以誘發(fā)該病的發(fā)生,其中F.graminearum是流行最廣、危害最大的一種。赤霉病不僅會造成作物的毀滅性減產(chǎn),還會降低籽粒品質。更為糟糕的是,F(xiàn).graminearum可以分泌脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等真菌毒素,使人畜食用后中毒。宿主抗性是控制這一病害的最安全、有效、經(jīng)濟、環(huán)保的方法。目前小麥抗赤霉病的分子機制尚不明確。因此,本研究以含有抗赤霉病基因F
2、hb1的抗病近等基因系(Near-IsogenicLine-Resistant,NIL-R)和不含抗赤霉病基因Fhb1的感病近等基因系(Near-IsogenicLine-Susceptible,NIL-S)為材料,利用全二維氣相色譜-飛行時間質譜(Comprehensivetwo-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrometry,GC×GC-TOF MS)對
3、接種F.graminearum后0、6、12、24、48、72和96小時(Hours post inoculation,hpi)的小麥穎殼代謝圖譜進行比較分析,從代謝物水平探討小麥赤霉病抗性機制。同時,用spike-in試驗對小麥代謝物分離、檢測平臺和代謝組學數(shù)據(jù)分析平臺的可行性,以及儀器檢測到的豐度變化(Fold-change,F(xiàn)C)與實際濃度變化之間的關系進行分析。主要結果如下:
1.GC×GC-TOF MS可用于小麥代謝
4、物的分離、檢測。小麥代謝物中氨基酸類物質最多、含量最高。這些物質在一維方向無拖尾現(xiàn)象,在二維方向略有拖尾,但三維檢測顯示峰型正常;spike-in試驗中,在加入的27種酸中,25種可以被檢測到,而且23種酸在所有重復中均存在;90%代謝物的一維和二維時間的RSD值小于5%,幾乎100%代謝物一維和二維時間的RSD值小于10%。在p=0.05水平時,TPR、PPV(精確度)和F1(準確度)在各濃度組合中的最大值分別達0.58、0.60和0
5、.78。相對較高的F1值和適中的TPR和PPV值表明數(shù)據(jù)處理平臺可用于小麥代謝組學數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。
2.本研究將鑒定到的216個代謝物分為8個化學組和13個生物組,其中次生代謝物代謝(secondary metabolites metabolism)和氨基酸代謝(amino acid metabolism)是最主要的2個生物組,而氨基酸(amino acid)和有機酸(organic acid)則是最重要的2個化學組,多數(shù)氨基
6、酸和有機酸均參與次生代謝物代謝和氨基酸代謝。由此可知,次生代謝物代謝和氨基酸代謝在F.graminearum侵染過程中發(fā)揮重要作用。聚類分析和主成分分析顯示,F(xiàn).graminearum侵染的前96 h可以明顯分為4組:0hpi一組,6-24 hpi一組,48hpi為單獨的一組,最后一組是72-96 hpi,即侵染過程可以分為5個階段:0-6hpi是一個階段,6-24 hpi是第二階段,24-48 hpi是第三階段,48-72是第四階段,
7、而72-96 hpi是第五階段。這與前人對禾谷鐮刀菌侵染過程的觀察結果相吻合。
3.Statistical t-test中p<0.05或FC>1.32的代謝物被視為顯著差異代謝物。根據(jù)此標準共檢測到165個顯著差異代謝物(不考慮時間點的影響),這些顯著差異代謝物主要屬于氨基酸、有機酸、醇、脂肪酸和芳香酸類物質。檢測到的顯著差異代謝物因時間點的不同而異:在0、6、12、24、48、72和96 hpi分別檢測到53、61、58、7
8、3、57、64和41個顯著差異代謝物。有18個顯著差異代謝物至少在連續(xù)3個時間點出現(xiàn),被視為抗病相關代謝物(Resistance-related metabolites,RRMs)。此外,羥基己酸(Hydroxycaproic acid)、辛二酸(Octanedioic acid)、6-十四醇(6-Tetradecanol)、異丁二酸(Methymalomic acid)和環(huán)氧丙烷(Methyloxirane)幾乎僅在某一近等基因系中檢
9、測到,因此這5個代謝物也被視作RRMs,即共檢測到23個RRMs。
4.Pearson相關性分析共檢測到2111對顯著相關代謝物(540對代謝物顯著負相關,1571對代謝物顯著正相關),在KEGG數(shù)據(jù)庫中匹配到95條代謝途徑。根據(jù)代謝物相關性網(wǎng)絡的預測和KEGG數(shù)據(jù)庫中匹配到的代謝途徑的整合,構建小麥赤霉病抗性相關微衛(wèi)星代謝網(wǎng)絡。主要包括茉莉酸(Jasmonic aicd,JA)合成途徑、乙烯(Ethylene,ET)合成途徑
10、、生長素(Auxin)合成途徑、水楊酸(Salicylic acid,SA)合成途徑、腐胺(Putrescine)合成途徑、木質素(Lignin)合成途徑和角質(Cutin)合成途徑,其相應合成前體或合成單體表現(xiàn)如下:
1)角質合成單體stearate和腐胺合成前體ornithine的變化趨勢一致:在12-48 hpi,NIL-R中stearate和ornithine的豐度顯著高于NIL-S(p<0.05),在24-48 hp
11、i,NIL-R和NIL-S之間存在明顯不同的變化趨勢,即NIL-R呈下降趨勢,而NIL-S中上升趨勢。由此可知,cutin和putrescine在12-48 hpi階段起抗性作用。
2)在24-48 hpi之間,auxin合成前體trytophan在NIL-R和NIL-S中均呈下降趨勢,NIL-R中的豐度顯著高于NIL-S(p<0.05);并且,在此階段中,SA合成前體benzoic acid在NIL-R中的消耗量要高于NIL
12、-S;與NIL-S相比,NIL-R在6-12hpi階段含有更高豐度的linolenic acid;48-72 hpi,linolenic acid在NIL-R中的消耗量要顯著高于NIL-S。即auxin和SA在24-48 hpi階段發(fā)揮抗性作用,而JA則在6-12hpi和48-72 hpi兩個階段發(fā)揮抗性作用。
3)木質素合成前體p-coumaric acid和ET合成前體methionine在NIL-R和NIL-S中均呈上升
13、趨勢,NIL-R和NIL-S之間無顯著差異,說明小麥穎殼的木質化和ET為基本防御反應,與抗性反應無關。
5.小麥-F.graminearum之間的互作是涉及多個分子事件的復雜過程。從48 hpi處可以將F.graminearum早期侵染過程分成兩個時期。前48 hpi是F.graminearum的營養(yǎng)型侵染階段。在這一時期,首先是JA合成用于識別病菌的侵染,作為信號物質激活cutin的加厚,阻止F.graminearum菌絲的
14、侵染。當F.graminearum菌絲透過cutin侵入內(nèi)部時,putrescine和SA被順序激活形成HR和局部SAR,從而抑制病菌在侵染小穗中的生長和蔓延。此外,SA還可形成長距離SAR:SA先合成甲基水楊酸(Methyl salicylicacid,MeSA),隨后MeSA作為信號物質被傳遞到未侵染小穗,然后水楊酸結合蛋白2將MeSA分解成SA,從而在未侵染小穗形成SAR,阻止病菌在穗部擴展。HR導致的細胞死亡利于半腐生型真菌F.
15、graminearum的生長。因此,auxin在24-48 hpi被激活,逆轉后期的HR,抑制HR在侵染小穗中過度蔓延,同時形成局部SAR抑制病菌擴展。48 hpi之后,Auxin激活JA的合成,進而抑制細胞死亡和病菌生長(第二階段)。JA與脂類轉運蛋白結合被轉運至未侵染小穗形成長距離SAR,與第一階段SA形成的SAR結合,阻止病菌在穗部擴展。此外,JA可以形成可揮發(fā)的甲基茉莉酸,通過空氣傳播使未侵染穗子形成抗性反應??傊鄠€分子事件
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