2014年--遺傳學(xué)外文翻譯--早期和晚期人體惡性腫瘤中循環(huán)腫瘤dna的檢測(cè)（譯文）

1、<p><b>　　中文7530字</b></p><p>　　出處：Chetan B, Mark S, Leary R J, et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.[J]. Science Translational Medicine, 2014,

2、 6(224):1066-1072.</p><p>　　早期和晚期人體惡性腫瘤中循環(huán)腫瘤DNA的檢測(cè)</p><p>　　如何發(fā)展無(wú)創(chuàng)的方式去發(fā)現(xiàn)和監(jiān)視腫瘤一直是腫瘤學(xué)中的一個(gè)主要挑戰(zhàn)。我們?cè)?40位有著不同種癌癥的患者身上采用基于數(shù)字化PCR的技術(shù)去評(píng)估腫瘤循環(huán)DNA (ctDNA) 探測(cè)癌癥的能力。我們發(fā)現(xiàn)>75% 有著晚期胰腺，卵巢，結(jié)腸，膀胱，胃，乳腺，黑色素，肝細(xì)胞或頭頸

3、部癌癥的患者體內(nèi)的ctDNA是可探測(cè)的，但是只有不到百分之五十患有原發(fā)性腦，腎，前列腺或甲狀腺癌的患者中可探測(cè)到ctDNA。在有著局部腫瘤的患者中，結(jié)腸癌，胃癌，胰腺癌和乳腺癌ctDNA的可探測(cè)率分別是73%, 57%, 48%和50%。ctDNA經(jīng)常出現(xiàn)在沒(méi)有循環(huán)腫瘤細(xì)胞的患者中，暗示這兩種生物標(biāo)記物是不同的存在。在有著206名轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者的一組單獨(dú)實(shí)驗(yàn)對(duì)象中，我們發(fā)現(xiàn)有臨床相關(guān)KARS基因突變的ctDNA可探測(cè)率是87.2% ，

4、且特異性是99.2% 。最終，我們?cè)?4位對(duì)治療有著客觀響應(yīng)但隨后復(fù)發(fā)的患者身上對(duì)ctDNA是否能夠提供表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑潛在抗性機(jī)制的線索進(jìn)行評(píng)估，這些患者中的23人(96%) 在涉及促分裂原活化蛋白激酶通路的基因中發(fā)展出一個(gè)或更多的突變?？傊?，這些數(shù)據(jù)暗示ctDNA是一個(gè)明顯適用的，敏感的</p><p><b>　　簡(jiǎn)介</b></p><p>　　在美國(guó)，

5、癌癥今年就會(huì)發(fā)生在多于160萬(wàn)的個(gè)體身上，但是一個(gè)經(jīng)過(guò)臨床證明的可以用來(lái)幫助指導(dǎo)病人管理的循環(huán)生物標(biāo)記只適用于他們中的少部分，甚至是在廣泛轉(zhuǎn)移的設(shè)置中(1–6). 盡管基于血漿的蛋白生物標(biāo)記比如癌抗原-125(CA-125), 癌胚抗原(CEA) 和前列腺特異性抗原(PSA) 通常用于這一目的，但這些蛋白也存在于不患癌癥的個(gè)體的血漿中，雖然濃度較低(2–4). 此外，在晚期癌癥患者體內(nèi)這些標(biāo)記并沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)相當(dāng)大程度的增加(5, 6)。&

6、lt;/p><p>　　隨著負(fù)責(zé)人體癌癥產(chǎn)生和發(fā)展的基因改變的發(fā)現(xiàn)，尋找新一代生物標(biāo)記成為了可能(7–11) 。隨著源自近來(lái)癌癥基因測(cè)序研究的基因信息的匯總，現(xiàn)在已知幾乎每一種癌癥都有體細(xì)胞基因改變。這些改變包括單堿基替換，插入，刪除和易位（后者包括那些與基因融合，基因擴(kuò)增或雜合性缺失的產(chǎn)物）。這些體細(xì)胞突變以可忽略的頻率發(fā)生在普通細(xì)胞群體中并因此提供從生物學(xué)視角上坎精巧的特定生物標(biāo)記。</p><

7、;p>　　有兩種腫瘤DNA可以在循環(huán)中被非侵入性的評(píng)估：無(wú)細(xì)胞腫瘤循環(huán)DNA(ctDNA)和循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）(12, 13)。ctDNA 由與細(xì)胞或細(xì)胞碎片無(wú)關(guān)的核酸小碎片組成。相反，CTCs展現(xiàn)著完整，經(jīng)常是存活的，可通過(guò)物理化學(xué)特性或者區(qū)別于其他普通血細(xì)胞的細(xì)胞表面分子從血液中純化的細(xì)胞(15) </p><p>　　盡管只有少量的研究比較過(guò)同一病人體內(nèi)的CTCs數(shù)量和ctDNA模板(16–19

8、)，但許多研究已經(jīng)表明ctDNA和CTCs都出現(xiàn)在晚期腫瘤中。比較這兩種的方法的研究出現(xiàn)了相反的結(jié)論，很可能是因?yàn)榧夹g(shù)問(wèn)題限制了對(duì)ctDNA 或CTC成分的理解。此外，盡管ctDNA真的可能來(lái)自CTCs，但是ctDNA 或CTC釋放入循環(huán)系統(tǒng)的機(jī)制尚不明確。這一研究的目的之一就是對(duì)同一病人采用無(wú)偏倚方法后比較ctDNA 和 CTCs在循環(huán)中的含量。</p><p>　　至今大部分ctDNA的研究各自評(píng)估有著單型腫

9、瘤的患者。鑒于這些研究中DNA的準(zhǔn)備和分析技術(shù)有著顯著的不同，所以很難去直接比較不同腫瘤類型ctDNA的含量(16, 20–26) 。因?yàn)閿?shù)據(jù)報(bào)道形式的不同，研究間的比較同樣也很有挑戰(zhàn)性。舉例來(lái)說(shuō)，比較實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的結(jié)果和那些評(píng)估突變模板分子碎片的結(jié)果是幾乎不可能的，或者用基于血清分析的結(jié)果去比較基于血漿分析的結(jié)果，也同樣不可能。為了直接比較不同類型的癌癥和為了確定臨床應(yīng)用ctDNA測(cè)量有效的癌癥的光譜，我們?cè)诋?dāng)前研究中評(píng)估了大量

10、類型的癌癥。我們對(duì)所有樣品使用標(biāo)準(zhǔn)化指南提純血漿和腫瘤DNA并使用數(shù)碼技術(shù)評(píng)估每種腫瘤的ctDNA水平，從而使我們能夠報(bào)道每個(gè)案例每毫升血漿的突變模板數(shù)(Fig. 1).這個(gè)方法也可以使我們直接比較兩種在循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的最常見(jiàn)的腫瘤特異性遺傳學(xué)變化形式：?jiǎn)位蛱鎿Q和重排。</p><p>　　CtDNA最直接的應(yīng)用之一被術(shù)語(yǔ)化為“液體活組織檢查” (20). 在研究和臨床實(shí)踐中，很難獲得用于基因分析的腫瘤樣本。一些腫

11、瘤（比如肺癌）只有通過(guò)細(xì)針穿刺才能得到并不足夠用于基因型分析的材料，反之在其他情況下從不同醫(yī)療中心獲取樣本會(huì)很有挑戰(zhàn)性或者很耗時(shí)(27). 此外，一旦一個(gè)靶向治療用于有著多種轉(zhuǎn)移瘤的病人，臨床醫(yī)生可以經(jīng)常尋找復(fù)發(fā)的早期證據(jù)或者潛在抗性的機(jī)制，這是一種液體活組織檢查特別有價(jià)值的情況。例如，他們可以提供全部腫瘤負(fù)荷的暫時(shí)性測(cè)量值和識(shí)別治療期間上升的特異性基因突變(16, 20, 21, 23, 28, 52). 盡管液體活組織檢查的方式證明

12、是有前途的，但它相關(guān)于傳統(tǒng)腫瘤活組織檢查的敏感性和特異性并沒(méi)有在一個(gè)大的臨床相關(guān)群組中被評(píng)估。這里，我們?cè)谑褂帽砥どL(zhǎng)因子受體抑制劑結(jié)腸癌患者(CRCs)身上評(píng)估這一方法的特異性和敏感性。我們也使用液體活組織檢查的方法在最初應(yīng)答表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑的患者身上鑒別負(fù)責(zé)復(fù)發(fā)的的基因突變?？偟膩?lái)說(shuō)，對(duì)ctDNA測(cè)量用于評(píng)估有不同癌癥的患者，這些研究提供了其潛在價(jià)值與局限的豐富信息。</p><p><b>

13、　　結(jié)果</b></p><p><b>　　有著轉(zhuǎn)移癌的患者</b></p><p>　　我們從評(píng)估來(lái)自14種不同組織類型的136例轉(zhuǎn)移癌和41位有著原發(fā)性腦腫瘤（神經(jīng)膠質(zhì)瘤和成神經(jīng)管細(xì)胞瘤）的患者開(kāi)始這項(xiàng)研究。原發(fā)性腦腫瘤被包括在這項(xiàng)評(píng)估內(nèi)是因?yàn)楸M管它幾乎不轉(zhuǎn)移但它通常是致命的。我們同樣也包括了10例額外的案例，由三期卵巢癌（n=7）和肝細(xì)胞癌（n=3

14、）組成，這個(gè)特別的評(píng)估是因?yàn)樗钠诎咐浅Ｏ∮胁⑶以谶@兩種癌癥中三期疾病更具有晚期腫瘤的代表性。這些患者的臨床特征被總結(jié)為表一。靶向測(cè)序，外顯子測(cè)序或全基因組測(cè)序被用來(lái)識(shí)別癌癥中的基因突變，就像輔助材料及方法中描述的那樣。在這些晚期案例中，至少一個(gè)基因改變—一個(gè)點(diǎn)突變（151例）或者基因重排（36例）—被發(fā)現(xiàn)在每一個(gè)癌癥研究者中(S1表)。除了在KRAS, NRAS, PIK3CA, 和BRAF（眾所周知體細(xì)胞中的） 這些已知熱點(diǎn)基因中發(fā)

15、生基因突變的子集外 ，通過(guò)評(píng)估同一患者非腫瘤性細(xì)胞的DNA，所有其他基因突變被證明也發(fā)生在體細(xì)胞中。ctDNA通過(guò)三種數(shù)字化方法中的一種進(jìn)行評(píng)估（見(jiàn)補(bǔ)充材料和方法）。當(dāng)應(yīng)用于同一血漿樣本，這些方法產(chǎn)生了可比較的結(jié)果（圖s1）并且從5ml血漿提純的DNA中全部可以探測(cè)到一個(gè)突變模板。每個(gè)病人的可</p><p>　　大部分有著腦外實(shí)體瘤的被研究患者被檢測(cè)到ctDNA(112/136; 82%). 然而，有著可探測(cè)c

16、tDNA的部分患者因腫瘤種類而異(似然比檢驗(yàn), P < 0.001). 如圖2A和圖S2所示，大部分有著三期卵巢癌，肝癌和胰腺，膀胱，結(jié)腸，胃，乳腺，肝臟，食道和頭頸部轉(zhuǎn)移癌，以及成神經(jīng)細(xì)胞瘤和和黑色素瘤的患者有著可探測(cè)水平的ctDNA。相反，少于50%有著成神經(jīng)管細(xì)胞瘤或腎臟，前列腺，甲狀腺轉(zhuǎn)移瘤的患者和少于百分之十有著神經(jīng)膠質(zhì)瘤的患者有可探測(cè)水平的ctDNA。有著圖2A描述的腫瘤類型的患者數(shù)量是很少的，這限制了不同類型腫瘤間比

17、較的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有著神經(jīng)膠質(zhì)瘤（低或高水平，表S1）的患者相比有著胰腺，結(jié)腸，乳腺，食管/胃或者卵巢轉(zhuǎn)移癌的患者更低可能有ctDNA（圖2A和圖S2）。</p><p>　　盡管ctDNA在大部分有著轉(zhuǎn)移癌的患者中是可檢測(cè)的，但ctDNA的濃度因病人而異，甚至是在那些同種類癌癥中（圖2B和表S1）。有些這種變率是因?yàn)樵诓煌[瘤中化驗(yàn)基因的拷貝數(shù)是不一樣的。舉例來(lái)說(shuō)，如果患者A腫瘤中的待測(cè)基因放大50倍，然而患者

18、B腫瘤中的待測(cè)基因呈現(xiàn)正常的拷貝數(shù)，那么患者A的ctDNA量預(yù)期是患者B的50倍（見(jiàn)“ctDNA中單堿基替換與重排的比較”）。然而，在只有非放大基因(例如 TP53) 被評(píng)估的癌癥中觀測(cè)到很大程度的變異性。</p><p><b>　　有著局部疾病的患者</b></p><p>　　我們下一步評(píng)估有著局部疾病患者體內(nèi)的ctDNA，就是說(shuō)，在樣本采集期間沒(méi)有臨床上或者放

19、射線檢查的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移證據(jù)。在有著所有被評(píng)估種類局部癌癥的233名患者中，55%患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)可探測(cè)水平ctDNA（233名患者中的122名，表S1）。這部分低于來(lái)自所有腫瘤類型有著充足可用樣本的轉(zhuǎn)移性疾病患者（乳腺，結(jié)腸，胰腺和胃食管；圖3A；模型擬合及分層卡方檢驗(yàn)；P < 0.001 ）的觀測(cè)值?？蓹z測(cè)水平ctDNA出現(xiàn)在49%到78%有著這四種局部腫瘤的患者中以及86%到100%有著這四種轉(zhuǎn)移性腫瘤的患者中（圖3A）。</p

20、><p>　　有著可探測(cè)水平ctDNA患者比例的不同也與病程有關(guān)：47%一期任何癌癥的患者有著可探測(cè)ctDNA，然而2，3，4期癌癥病人有可探測(cè)ctDNA的比例各自是55%，69%和82%（圖3B,薩默斯指數(shù)等級(jí)相關(guān)=0.337）。同理，血漿中ctDNA濃度隨著病程上升。</p><p>　　比較ctDNA和CTCs</p><p>　　這些實(shí)驗(yàn)中，DNA孤立于離心分離

21、后得到的血液中的細(xì)胞區(qū)室，這些顆粒包括CTCs和白細(xì)胞（WBCs），血小板，和其他細(xì)胞成分。在每個(gè)樣例中，腫瘤DNA的全基因組測(cè)序被用于鑒別體細(xì)胞重排?；赑CR的試驗(yàn)被用于識(shí)別相同患者那些血液顆粒(CTCs) 或者血液上清液(血漿)中的重排。這些實(shí)驗(yàn)可以在腫瘤特異性重排下進(jìn)行但不能在腫瘤特異性點(diǎn)突變下進(jìn)行，原因見(jiàn)討論。我們沒(méi)有識(shí)別到任何CTCs可探測(cè)但ctDNA不存在的案例。然而在許多ctDNA可被檢測(cè)到的情況下(1中13個(gè); 81%

22、) ，沒(méi)有CTCs可在相同實(shí)驗(yàn)中被探測(cè)(表2). 此外，在CTCs和ctDNA水平都可檢測(cè)的三個(gè)案例中，血漿中突變碎片的平均數(shù)量大于50被CTCs中的類似水平。</p><p>　　ctDNA中單堿基替換與重排的比較</p><p>　　我們也感興趣于比較同一患者的循環(huán)中兩種不同種類DNA碎片的基因?qū)W改變。盡管這項(xiàng)研究中實(shí)際問(wèn)題使我們不能鑒別所有患者中的基因重排（見(jiàn)討論），但在19名患者中

23、腫瘤特異性重排和腫瘤特異性點(diǎn)突變被識(shí)別（表S2）。一個(gè)例外是一名在TP53有著循環(huán)點(diǎn)突變的患者，這名患者腫瘤中的重排鑒定不能在她的血漿中被識(shí)別（表S2）。有著點(diǎn)突變的循環(huán)DNA碎片的絕對(duì)數(shù)量相對(duì)重排是高度相關(guān)的（圖4；相關(guān)系數(shù)=0.96）。然而，在四名病人體內(nèi)，含有重排的循環(huán)碎片數(shù)量大于十倍含有待測(cè)點(diǎn)突變的循環(huán)碎片數(shù)量（表S2），這一現(xiàn)象的原因是我們選擇用來(lái)分析重排的基因在腫瘤中經(jīng)常出現(xiàn)基因擴(kuò)增的結(jié)果，然而點(diǎn)突變通常在每個(gè)腫瘤基因組中只

24、出現(xiàn)一次。</p><p>　　液體活組織檢查的敏感性和特異性</p><p>　　上述結(jié)果是通過(guò)首先在腫瘤中識(shí)別基因突變?nèi)缓鬁y(cè)定血漿中是否有相同可探測(cè)突變的方法獲得的。對(duì)特定液體活組織檢查的應(yīng)用，腫瘤的基因突變事先未知并且所有相關(guān)突變被馬上標(biāo)為待測(cè)。為了測(cè)定液體活檢方法的敏感性，我們盲法評(píng)估206名有著轉(zhuǎn)移性CRC患者的血漿和腫瘤（表S3）。這一隊(duì)病人完全獨(dú)立于上文提及和在S1,S2表中

25、的410名病人。對(duì)每例樣本，我們界定KARS第12，13位堿基突變是否既在原發(fā)性癌又在2ml治療前抽提血漿中出現(xiàn)。KARS基因被選中用于這一研究是因?yàn)樗呐R床相關(guān)性；在原發(fā)性腫瘤中KARS基因突變的出現(xiàn)是使用抗體抑制EGFR來(lái)治療轉(zhuǎn)移性CRC患者的先決條件(29)。我們識(shí)別了69名患者在血漿中有著循環(huán)突變KARS(206人中的33%) 。128名有著KARS野生型癌癥的患者中127人沒(méi)有被檢測(cè)出循環(huán)KARS突變，得出未修正的特異性99.

26、2%。在69例血漿樣本中鑒別到的基因突變與腫瘤中鑒別到的完全相同，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了液體活組織檢查的特異性。除了這69例腫瘤，我們鑒別了10例（206例中）基因突變出現(xiàn)在原發(fā)性腫瘤但不在血漿中的樣本，得出敏感度是87.2% 。在血漿和腫瘤組織中KARS突變狀</p><p>　　為了更好地理解觀測(cè)到的假陰性結(jié)果，我們下一步評(píng)估了26個(gè)臨床和病理學(xué)特點(diǎn)，（表S3和S4）。與假陰性ctDNA結(jié)果（腫瘤中有KARS基因突變但

27、是血漿中沒(méi)有可探測(cè)基因突變）相關(guān)的的現(xiàn)象是低CEA水平，黏蛋白組織學(xué)，低水平丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，WBC數(shù)量少，和更年輕（表S4和S5）。CEA水平也顯然與血漿中突變KARS碎片濃度有關(guān)（表S6與S7）。低腫瘤負(fù)荷（從通常CEA水平中體現(xiàn)）與低ctDNA水平相關(guān)的這一想法與觀測(cè)值是一致的。</p><p>　　我們下一步檢測(cè)ctDNA濃度與存活率的關(guān)系。從一個(gè)有著已知預(yù)后因素（年齡，東部腫瘤協(xié)作組ECOG體力狀況PS，和

28、CEA）的模型開(kāi)始,并假設(shè)這些評(píng)估變量是線性的，我們發(fā)現(xiàn)ctDNA濃度為預(yù)測(cè)存活提供了附加價(jià)值（似然比檢驗(yàn)，P=0.00253,df=3）。隨后我們?cè)u(píng)估不同ctDNA水平的兩年存活率，包括其他預(yù)測(cè)變量（圖5）。我們觀測(cè)到隨著ctDNA濃度的上升存活率穩(wěn)定下降</p><p>　　檢測(cè)患者的抗性獲得基因突變</p><p>　　液體活組織檢查同樣可用來(lái)監(jiān)控靶向藥物治療的患者，提供復(fù)發(fā)的早期預(yù)

29、警和抗性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)的信息。舉例來(lái)說(shuō)，KARS第12，13位密碼子突變出現(xiàn)在24名患者中的38%，這些患者最初響應(yīng)了EGFR抑制劑但隨后疾病進(jìn)展（20）。在每個(gè)案例中，KARS基因突變沒(méi)有出現(xiàn)在原發(fā)性腫瘤中但推測(cè)起來(lái)產(chǎn)生在轉(zhuǎn)移病灶的少量細(xì)胞中，并在EGFR抑制劑的影響下擴(kuò)散。這里我們希望確定除了在KARS12，13堿基處的突變外，是否有其他的抗性突變可以在EGFR抑制劑治療患者的液體活組織檢查中發(fā)現(xiàn)。我們因此設(shè)計(jì)了一個(gè)多路，基于測(cè)序化驗(yàn)

30、去檢測(cè)EGFR通路幾個(gè)基因中的已知突變熱點(diǎn)：在KARS 第12，13，59，60和61堿基位點(diǎn)內(nèi)和周圍的區(qū)域；NARS第12，13，59，60和61堿基位點(diǎn)；BRAF 第599和600堿基位點(diǎn)；EGFR第 712至721，738，748，790至800，和847至895堿基位點(diǎn)；以及PIK3CA第538至549和1039至1050堿基位點(diǎn)。24個(gè)被評(píng)估的案例中包括17個(gè)之前評(píng)估過(guò)KARS基因突變的案例（20）和7個(gè)額外的患者使用EGFR

31、抑制抗體治療，最初應(yīng)答但隨后病程進(jìn)展的案例（帕尼單抗或西</p><p>　　在24名患者中我們識(shí)別到23人（96%）在胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路基因有著至少一個(gè)自發(fā)的循環(huán)突變。每個(gè)患者的循環(huán)中識(shí)別到的不同突變數(shù)平均值為2.9（區(qū)間0-12）.同一患者中不同突變的的發(fā)展為自身的多發(fā)性病變是并不奇怪的；每種響應(yīng)EGFR阻斷劑的病變被期望擁有至少一個(gè)耐藥性突變（20,30）.</p><p>　　總

32、共，我們觀察到70例在使用EGFR阻斷劑之前沒(méi)有腫瘤或者血漿中檢測(cè)到的體細(xì)胞突變，只出現(xiàn)在治療開(kāi)始之后（表S8和圖6）.一般的突變（70中的34例）出現(xiàn)在KARS第12密碼子。當(dāng)這些突變出現(xiàn)在原發(fā)性腫瘤中被認(rèn)為導(dǎo)致了EGFR阻斷劑的抗性，并被觀察到使用EGFR阻斷劑后水平提高不論是在體內(nèi)還是體外（20,30）。BARF中的一個(gè)突變被觀察到。之前的幾項(xiàng)研究表明BRAFV600E突變，當(dāng)出現(xiàn)在原發(fā)性腫瘤中時(shí)，與無(wú)法響應(yīng)EGFR阻斷劑相關(guān)（3

33、1-33）。兩個(gè)其他患者在EGFR激酶結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)突變（密碼子714和794，表S8和圖6）。這些篩留物中的突變之前在原發(fā)性CRC中被觀測(cè)到，雖然并不經(jīng)常，同時(shí)EGFR阻斷劑的抗性顯示是由EGFR基因遺傳學(xué)改變所導(dǎo)致（34,35）。我們沒(méi)有識(shí)別在已知PIK3CA基因熱點(diǎn)的治療相關(guān)突變（外顯子9和20）（36）</p><p>　　我們研究組成中最讓人驚訝的EGFR阻斷劑觀察是KRAS或NRAS基因61位密碼子的大量

34、突變（表S6和圖6）.24位患者中的15人（62.5%）擁有至少一個(gè)61位密碼子突變，這15位患者擁有所觀測(cè)到的總計(jì)31個(gè)突變的百分之45（69），48%的61位密碼子突變出現(xiàn)在NRAS其余在KRAS中（表S6和圖6）.</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　通過(guò)所研究的640位患者，我們發(fā)現(xiàn)突變DNA碎片相對(duì)較多的集中在轉(zhuǎn)移性癌癥中被發(fā)現(xiàn)，以

35、及在大部分有著局部癌癥的患者中有著較低但是可探測(cè)的水平。這些結(jié)果有著多種可解讀的含義以及為將來(lái)的研究建議了重要的途徑。</p><p>　　檢測(cè)晚期癌癥患者的疾病</p><p>　　一個(gè)遺傳性改變可以在這部分研究評(píng)估的所有410位患者的腫瘤中被識(shí)別，使得ctDNA對(duì)癌癥患者來(lái)說(shuō)是一個(gè)可廣泛應(yīng)用的生物標(biāo)記。此外多于80%有著轉(zhuǎn)移性疾病的患者有著可探測(cè)水平的ctDNA，高于大部分有記錄的常用

36、生物標(biāo)記（37）.與既在普通細(xì)胞又在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的CEA或者CA19-9蛋白質(zhì)不同，克隆性的遺傳學(xué)改變只出現(xiàn)在腫瘤中。我們的數(shù)據(jù)指出ctDNA的測(cè)量同樣可以提供有著轉(zhuǎn)移性癌癥患者的治療方法，預(yù)測(cè)以及預(yù)后方面的信息。如圖5所示，有著相當(dāng)?shù)退絚tDNA的轉(zhuǎn)移性CRC患者比高水平患者的壽命顯著延長(zhǎng)，并且在ctDNA濃度和存活率間有著顯著相關(guān)性。一個(gè)存活率與ctDNA濃度間類似的相關(guān)性最近在晚期乳腺癌患者中被報(bào)道（16）。</p>

37、;<p>　　盡管ctDNA這些優(yōu)點(diǎn)使得它對(duì)于監(jiān)控患者是很有前途的，但也有潛在的局限性。特異的突變被原發(fā)性癌癥的評(píng)估所界定，對(duì)于患者的管理既需要投入時(shí)間也需要費(fèi)用。將來(lái)這會(huì)變得阻礙更小，因?yàn)楦嗟陌┌Y患者將會(huì)對(duì)他們的腫瘤進(jìn)行遺傳學(xué)分析以便于指導(dǎo)治療決定。這些過(guò)去常常用于指導(dǎo)治療的遺傳學(xué)改變同樣可被用于ctDNA分析。涉及監(jiān)控晚期癌癥患者的實(shí)用性的一個(gè)更嚴(yán)肅的問(wèn)題是，使用ctDNA還是生物標(biāo)記（38，39）。一方面，患者和他

38、們的內(nèi)科醫(yī)生焦急地想盡快知道疾病是否進(jìn)展。設(shè)想研究經(jīng)常是無(wú)告知性的或者遲鈍的反應(yīng)疾病進(jìn)展。再設(shè)想受試患者受到輻射，但是ctDNA的監(jiān)測(cè)是非侵入性的。另一方面，尚未顯示使用任何生物標(biāo)記監(jiān)控晚期癌癥患者在臨床上有著類似于對(duì)心理效益的不利。在轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床癥狀前知道進(jìn)展（或應(yīng)答）可能并不會(huì)延長(zhǎng)生存或提高生命質(zhì)量。</p><p><b>　　方法論的比較</b></p><p>

39、;　　血液中有兩類可獲得的腫瘤DNA（CTCs和ctDNA），兩種類型的遺傳學(xué)改變可以在任一類型中很容易的被評(píng)估（點(diǎn)突變和易位）。早先比較ctDNA與CTCs的研究得到了混合的結(jié)論。舉例來(lái)說(shuō)，一個(gè)小組得出ctDNA的出現(xiàn)少于CTCs的結(jié)論（17）；這一組使用體現(xiàn)最高技術(shù)水平的方法去探測(cè)CTCs但是并沒(méi)有使用高敏感性的方法去探測(cè)ctDNA。第二組得出的結(jié)論是ctDNA比CTCs更經(jīng)常的出現(xiàn)（16）；這一組使用一種靈敏的方法去分析ctDNA

40、但是使用了幾乎不敏感的方法去探測(cè)CTCs。最近以來(lái)，在三名小兒成神經(jīng)細(xì)胞瘤患者中的兩位發(fā)現(xiàn)ctDNA的水平遠(yuǎn)高于CTCs（19）。</p><p>　　為了進(jìn)一步研究這個(gè)問(wèn)題，我們對(duì)來(lái)自有著典型實(shí)體瘤患者的同一血液樣本同時(shí)評(píng)估ctDNA與CTCs。我們僅把細(xì)胞性成分與血漿分離并鑒定細(xì)胞部分或細(xì)胞類似物，分別的，這其中的腫瘤特異性重排可以被鑒定。因?yàn)槲覀儧](méi)有試圖事實(shí)上從普通白細(xì)胞計(jì)數(shù)中分離腫瘤細(xì)胞，關(guān)系到CTC純化

41、效率的技術(shù)問(wèn)題被排除。來(lái)自CTCs和ctDNA的DNA間的比較并不能簡(jiǎn)單地通過(guò)點(diǎn)突變來(lái)展現(xiàn)，因?yàn)榛赑CR實(shí)驗(yàn)的點(diǎn)突變背景水平很高。這一背景妨礙了每十萬(wàn)細(xì)胞少于一個(gè)水平的點(diǎn)突變的探測(cè)。因?yàn)槊亢辽褐谐霈F(xiàn)有幾百萬(wàn)普通細(xì)胞但只有幾個(gè)CTCs，需要一種更靈敏的技術(shù)。重排的探測(cè)很適合這一任務(wù)，因?yàn)閾?jù)顯示在數(shù)百萬(wàn)野生型模板分子中一個(gè)突變可以被穩(wěn)定的探測(cè)；PCR錯(cuò)誤并不會(huì)形成特定的重排。</p><p>　　使用患者特異性

42、重排作為工具，我們能夠顯示ctDNA的水平總是高于CTCs。在16名患者中的13人的ctDNA水平非常高但是沒(méi)有任何CTCs可以被檢測(cè)到。這并不意味著ctDNA相對(duì)于CTCs更適合于檢測(cè)或監(jiān)控癌癥。不如說(shuō)最理想的技術(shù)取決于許多其他因素，包括費(fèi)用與生產(chǎn)力，這樣CTC探測(cè)有優(yōu)勢(shì)。然而，這些比較確實(shí)顯示絕大多數(shù)ctDNA并不是直接從CTCs中產(chǎn)生的。因?yàn)閏tDNA的半衰期很短（小于1.5小時(shí)），事實(shí)上比CTCs短(43)，我們的工作顯示血漿中

43、的變異分子并不是從CTCs中產(chǎn)生的。</p><p>　　另一個(gè)比較的興趣點(diǎn)關(guān)注于易位和點(diǎn)突變。我們的結(jié)果（表S2）顯示研究的案例中每毫升血漿ctDNA碎片中易位和點(diǎn)突變的數(shù)量是相似的。然而，在19個(gè)案例中的1個(gè)，一個(gè)點(diǎn)突變?cè)谘獫{樣本中被探測(cè)到但是所研究的易位是缺失的。這一現(xiàn)象可能的原因是點(diǎn)突變非常早的發(fā)生于腫瘤形成驅(qū)動(dòng)基因中，反之重排是亞克隆性的，可能并沒(méi)有貢獻(xiàn)于腫瘤的發(fā)展。在四個(gè)其他案例中，重排被探測(cè)到高于點(diǎn)

44、突變的十倍水平（表S2）。在這些案例中，重排被發(fā)現(xiàn)是體細(xì)胞擴(kuò)增基因的一部分。</p><p>　　從一個(gè)實(shí)際的角度出發(fā)，這些數(shù)據(jù)顯示如下的結(jié)論：通過(guò)使用出現(xiàn)擴(kuò)增子的重排來(lái)探測(cè)遺傳學(xué)改變可達(dá)到最大靈敏度。許多腫瘤，尤其是有著這些擴(kuò)增子的晚期腫瘤使得使用低覆蓋率（10x）基因組測(cè)序的方法來(lái)探測(cè)是非常簡(jiǎn)單的。正如CTCs與ctDNA間的比較一樣，這一較高靈敏度并不意味著臨床應(yīng)用上重排比點(diǎn)突變更受歡迎。</p>