蠟梅屬植物化學(xué)成分分析與ISSR分子標(biāo)記研究.pdf

1、蠟梅屬Chimonanthus Lindl.植物為中國所特有，包括6種和1變種:即蠟梅Ch.praecox(L)Link.、浙江蠟梅Ch.Zhejiangensis M.C.Liu、柳葉蠟梅Ch.salicifoliusS.Y.Hu、山蠟梅（亮葉蠟梅） Ch.nitens Oliv、突托蠟梅Ch.grammatus M.C.Liu、西南蠟梅Ch.campanulatus R.H.、及變種貴州蠟梅Ch.campanulatus var.g

2、uizhouensis R.H.Chang et C.S.Ding var.guizhouensis R.H.Chang。蠟梅屬植物極具觀賞性，也富含揮發(fā)油及其它次生代謝產(chǎn)物，具有較好的藥用價(jià)值。本文在前期種質(zhì)資源收集及遺傳多樣性分析的工作基礎(chǔ)上，主要開展了主要次生代謝產(chǎn)物的分布規(guī)律、全年動(dòng)態(tài)分析及分子標(biāo)記研究，為蠟梅屬植物的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。
　　 ⑴利用高效液相色譜(HPLC)，優(yōu)化色譜條件為Hibar C18色譜

3、柱(4.6mm×250mm，5μm);流動(dòng)相A為水溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序:0～20 min，B為6％～20％;20～30 min,B為20％～25％;30～40mm,B為25％～45％;40～50 min,B為45％～80％;50～80 min,B為80％～85％;80～90 min,B為85％～100％;90～110mm，B為100％;流速0.8 mL·min1;檢測波長228 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量:10μL。通過對(duì)5種蠟梅

4、屬植物共51份樣品的分析，構(gòu)建了5種蠟梅屬植物葉片化學(xué)成分的HPLC指紋圖譜。蠟梅、山蠟梅、柳葉蠟梅、浙江蠟梅和突托蠟梅在指紋圖譜中分別有24、30、22、34和30個(gè)共有峰，且5種蠟梅屬植物葉化學(xué)成分的HPLC指紋圖譜中色譜峰有較大差異，在種之間能夠明顯區(qū)分，因此該指紋圖譜能夠作為不同種的區(qū)分鑒別依據(jù)。
　　 ⑵選取從柳葉蠟梅中提取得到的莨菪亭-7-O-β-D-葡萄糖苷(1)、山柰酚-3-O-β-D-蕓香糖苷(2)、山柰酚-3

5、-O-β-D-葡萄糖苷(3)、槲皮素(4)、山柰酚(5)5個(gè)單體化合物作為對(duì)照品，在以上HPLC指紋圖譜中進(jìn)行指認(rèn)，確定它們?yōu)楣餐衔铩Ｍ瑫r(shí)測定5種蠟梅屬植物不同采收期葉片中的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同種及不同采收期化合物含量均存在顯著性差異，在不同采收期中，5個(gè)對(duì)照化合物含量存在著一定的變化規(guī)律;在蠟梅屬不同種中，化合物的含量分布也存著差異，因此在開發(fā)利用時(shí)要注意物種間差異。
　　 ⑶選取柳葉蠟梅為代表植物，研究其全年化學(xué)成分動(dòng)態(tài)

6、變化規(guī)律;12批次樣品的得油率差異較大，9月份樣品得油率最高，為1.66％，1月份樣品得油率最低，僅為0.70％。 GC-MS分析柳葉蠟梅中揮發(fā)油組成成分，共分離出65個(gè)化學(xué)成分，以 NIST08譜庫搜索鑒定了其中的61個(gè)化學(xué)成分。柳葉蠟梅葉揮發(fā)油的組成成分復(fù)雜，不同采收期的樣品，其揮發(fā)油組成成分有一定差別。植物在生理活動(dòng)比較活躍時(shí)，能產(chǎn)生較多的次生代謝物;通過不同采收期柳葉蠟梅葉5個(gè)化學(xué)成分的比較分析，可以得出其全年動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，5、

7、8和9月份為合理采收期，與揮發(fā)油結(jié)果較一致。
　　 ⑷針對(duì)不同種源的葉芳香型蠟梅屬植物進(jìn)行了化學(xué)成分和分子標(biāo)記的研究。采用頂空進(jìn)樣氣質(zhì)聯(lián)用法(Head-space GC-MS)測定不同種源葉芳香型蠟梅屬植物葉揮發(fā)性成分，共檢測到27種化學(xué)組分;不同種源間存在差異性，特別是突托蠟梅和其它種的揮發(fā)性成分差異性較大，該方法為蠟梅屬植物資源品質(zhì)控制和分類提供了依據(jù);經(jīng)HPLC分析，不同種源蠟梅屬植物葉5個(gè)化學(xué)成分的含量差異性很大，而且存

8、在顯著相關(guān)性，柳葉蠟梅淳安種源為優(yōu)勢種源，浙江蠟梅云和種源為優(yōu)勢種源，山蠟梅八角村種源為優(yōu)勢種源，突托蠟梅會(huì)昌種源5個(gè)化學(xué)成分的含量都較高。
　　 ⑸采用ISSR分子標(biāo)記，利用篩選的18條引物，對(duì)21個(gè)居群進(jìn)行遺傳多樣性分析。21個(gè)居群總遺傳多樣性（Ht）為0.2671，其遺傳多樣性在木本植物中屬于偏低水平，而生物遺傳多樣性在一定程度上代表了種群對(duì)環(huán)境變化適應(yīng)能力的強(qiáng)弱，說明葉芳香型蠟梅屬植物對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力較弱，對(duì)其采取保護(hù)措施