家蠶絲腺特異表達的bHLH轉(zhuǎn)錄因子Bmsage和Bmdimm的功能研究.pdf

1、家蠶絲腺是一種高度特異化的器官，能夠高效特異地合成絲蛋白，根據(jù)其結(jié)構可以分為前部、中部和后部絲腺。前部絲腺不合成蛋白，中部絲腺合成絲膠蛋白，后部絲腺合成絲素蛋白，絲素蛋白分為絲素重鏈蛋白（fib-H）、絲素輕鏈蛋白(fib-L)和P25蛋白，它們按6∶6∶1組合形成多聚體蛋白。在幼蟲各齡眠期和變態(tài)期，家蠶只合成少量或不合成絲蛋白，進入五齡盛食期，絲素和絲膠基因的轉(zhuǎn)錄水平大大提高，絲蛋白隨即被大量合成。研究表明，絲蛋白基因的表達主要是在轉(zhuǎn)

2、錄調(diào)控水平進行的，目前研究學者已經(jīng)在家蠶絲腺中發(fā)現(xiàn)了大量的轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子廣泛的參與絲腺器官的發(fā)育、絲蛋白基因的轉(zhuǎn)錄以及絲腺細胞的凋亡等生命過程。家蠶基因組數(shù)據(jù)和基因芯片數(shù)據(jù)的公布，為研究家蠶絲腺特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子提供了信息平臺。本研究根據(jù)之前發(fā)現(xiàn)的兩個在家蠶絲腺特異表達的并且含有bHLH結(jié)構域的轉(zhuǎn)錄因子—Bmsage和Bmdimm，采用克隆、表達、RT-PCR、western blot等技術對Bmsage和Bmdimm生物進化關系

3、、轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白質(zhì)水平的組織表達模式進行了分析和研究。同時，在細胞水平探討了它們在絲素重鏈蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用并且從分子生物學水平探討了保幼激素在家蠶絲蛋白合成過程中的作用，獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.家蠶Bmsage和Bmdimm原核表達及表達模式分析
　　進化分析發(fā)現(xiàn)，Bmsage同果蠅sage和小鼠Mesp等因子具有較高的相似性;Bmdimm同果蠅dimmed和小鼠Mist等因子具有較高的相似性。因此，我

4、們認為Bmsage屬于bHLH家族中的Mesp亞家族;而Bmdimm則同Mist因子一樣屬于Atonal亞家族。另外，將其克隆并原核表達了Bmsage和Bmdimm重組蛋白，其中Bmsage在37℃溫度下以包涵體形式表達，Bmdimm全長在該表達系統(tǒng)下不表達。對Bmdimm進行多種方式的截斷，發(fā)現(xiàn)第一種截短形式(187-636 aa)的蛋白以可溶蛋白形式在上清表達。通過各種蛋白柱的分離純化，獲得Bmsage和Bmdimm的純化蛋白。用這

5、兩個純化蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，效價均達到了512 k而且純度均在95％以上，表明可以用于后續(xù)相關實驗。組織表達分析表明:在轉(zhuǎn)錄水平上，Bmsage和Bmdimm在家蠶絲腺組織中表達，Bmdimm在中腸中存在少量表達，這與家蠶芯片表達譜分析的數(shù)據(jù)基本一致。進一步分析發(fā)現(xiàn)在前部、中部和后部絲腺中均能檢測到Bmsage和Bmdimm的轉(zhuǎn)錄本存在;在蛋白質(zhì)水平上，Bmsage和Bmdimm只存在于絲腺組織中，而且只在中部和后部絲腺

6、，其中Bmdimm在后部絲腺的量明顯高于中部絲腺。不同時期RT-PCR分析表明，Bmsage和Bmdimm的表達從四眠中后期開始逐漸升高，到五齡6-7天達到最高，隨后到成熟期表達逐漸降低直到化蛹表達終止，這一表達模式與絲素重鏈基因(fib-H)相似。通過對低絲量品種大造和高絲量品種872絲腺中Bmsage、Bmdimm和fib-H的轉(zhuǎn)錄本qRT-PCR定量分析發(fā)現(xiàn)，Bmsage和Bmdimm基因在872的后部絲腺表達量顯著高于大造，而且

7、Bmdimm基因在后部絲腺表達量同樣高于中部絲腺，而872品種后部絲腺中fib-H的轉(zhuǎn)錄本約是大造的3倍，結(jié)果表明Bmsage和Bmdimm極有可能參與fib-H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　2.Bmsage對家蠶絲素重鏈基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　轉(zhuǎn)錄因子一般是協(xié)同其它因子對下游靶標基因的表達進行調(diào)控。Western blot分析發(fā)現(xiàn)，家蠶絲腺fork head因子SGF1和Bmsage一樣均在家蠶中部和后部絲腺表達，為證實Bmsage是

8、否與SGF1存在相互作用，利用體外重組蛋白進行了far-western blot和ELISA實驗，結(jié)果表明，Bmsage能夠在體外與SGF1相互作用。為進一步驗證該結(jié)果，在家蠶胚胎細胞系中進行了免疫熒光和免疫共沉淀(co-IP)實驗，結(jié)果顯示與體外實驗一致，表明Bmsage和SGF1能夠相互作用。凝膠阻滯實驗(EMSA)結(jié)果顯示，重組表達的Bmsage和SGF1蛋白在體外孵育后，通過SGF1結(jié)合到fib-H啟動子上的近端區(qū)A和B位點上。

9、fib-H啟動子缺失實驗表明A和B位點是SGF1對fib-H的表達調(diào)控位點，這些表明Bmsage和SGF1蛋白形成復合物，通過SGF1結(jié)合到A和B位點上調(diào)控fib-H的表達。
　　3.Bmdimm對家蠶絲素重鏈基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　為分析fib-H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，利用家蠶基因組數(shù)據(jù)庫下載其轉(zhuǎn)錄起始位點上游約1000 bp區(qū)域，預測分析顯示這段啟動子區(qū)域中除了存在近端區(qū)和遠端區(qū)的A、B、C、D和E位點外，還存在著E-box、

10、βFTZ-F1和POU等轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點。染色質(zhì)免疫共沉淀實驗(ChIP)結(jié)果顯示，Bmdimm能夠與fib-H啟動子區(qū)域中的E-box(CAAATG)元件結(jié)合，EMSA實驗進一步驗證了該結(jié)果。Bmdimm除了與CAAATG元件結(jié)合外還可以與其它幾種形式的E-box結(jié)合，如CAATTG、CAACTG等，這表明Bmdimm結(jié)合位點并不是唯一的，暗示著可能參與其它基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如fib-L和P25等。定點突變實驗結(jié)果顯示Bmdimm堿性區(qū)域保

11、守的第113位精氨酸是結(jié)合CAAATG元件的關鍵位點。啟動子缺失實驗顯示，缺失了該E-box位點的fib-H啟動子在過表達Bmdimm后的活性幾乎沒有變化而正常的啟動子活性顯著增加，表明Bmdimm可以通過該E-box位點調(diào)控fib-H基因的表達。bHLH轉(zhuǎn)錄因子可以通過其bHLH結(jié)構域相互作用形成同源或異源二聚體，然后通過二聚體中的一段保守堿性區(qū)域與特定的DNA序列進行結(jié)合進而調(diào)控靶標基因的表達。為證實Bmdimm是否與Bmsage存

12、在相互作用，利用體外重組蛋白進行了far-westem blot和ELISA實驗，結(jié)果表明，Bmdimm在體外能夠與Bmsage相互作用。為進一步驗證該結(jié)果，在家蠶胚胎細胞系中進行了免疫熒光和co-IP實驗，結(jié)果顯示與體外實驗一致，表明Bmdimm和Bmsage能夠相互作用。為了分析Bmdimm的調(diào)控網(wǎng)絡，預測分析了Bmdimm基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游約2000 bp的啟動子區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在fork head可能的反應元件，暗示SGF1在

13、Bmdimm基因的表達中可能起著調(diào)控作用。EMSA實驗表明SGF1可以與fork head元件結(jié)合，同時在細胞中過表達SGF1后，Bmdimm啟動子活性明顯升高，而且qRT-PCR結(jié)果顯示Bmdimm在細胞中的表達量也明顯提高。
　　4.保幼激素對家蠶絲素基因的調(diào)控
　　通過對Bmdimm基因啟動子預測得到多個與昆蟲激素相關的可能反應元件，包括Kr，E-box，BR-C，E74A和FTZ-F1，這些元件已被證實可能是昆蟲激素

14、信號傳導途徑中的重要轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合元件，調(diào)控下游目的基因的表達，尤其Kr位點是保幼激素早期響應基因Kr-h1的潛在結(jié)合元件，暗示著Bmdimm基因可能受到保幼激素信號途徑的調(diào)控作用。用保幼激素類似物(JHA)處理五齡早期家蠶發(fā)現(xiàn)，家蠶五齡齡期經(jīng)過延長2-3天;qRT-PCR結(jié)果顯示與對照相比fib-H基因及其調(diào)控因子Bmdimm基因的表達量在前期有所下降，隨著齡期發(fā)育逐漸升高，并出現(xiàn)延時表達。同時發(fā)現(xiàn)，JH早期反應基因BmKr-h1在前

15、期表達量升高，隨后隨著JH受體表達降低而降低，到五齡末期也出現(xiàn)延時表達。絲腺體外培養(yǎng)結(jié)果顯示BmKr-h1的表達趨勢與Bmdimm類似。在家蠶BmE細胞系中，用不同濃度的JHA誘導不同時間發(fā)現(xiàn)Bmdimm具有JH濃度和誘導時間依賴性。BmKr-h1位于JH受體BmMet2的下游響應JH的誘導表達，而且過表達BmKr-h1后Bmdimm的表達量提高而蛻皮激素初級反應基因Brc-Z2和Brc-Z4的表達受到抑制，表明在家蠶細胞系中存在激素信