中藥方“蒲和飲”對(duì)小鼠的抗炎效果及抗炎機(jī)制研究.pdf

1、炎癥反應(yīng)（Inflammation）作為生物機(jī)體對(duì)致炎因子所發(fā)生的自動(dòng)的防御反應(yīng)，主要表現(xiàn)為紅(Redness)、腫(Swelling)、熱(Heat)、痛(Pain)和功能障礙(Loss of Function)五大醫(yī)學(xué)臨床癥候，尤其是發(fā)熱、紅腫、疼痛這些臨床癥候與中醫(yī)的“熱”證型如高熱、汗出、舌紅苔黃、肌膚生瘡等癥候相似。據(jù)中醫(yī)的病因病機(jī)觀(guān)點(diǎn)，“陽(yáng)勝則熱”，機(jī)體感受熱邪、或外感寒邪化熱、或內(nèi)有郁積化熱而致“熱”證，中醫(yī)對(duì)“熱”證（炎

2、癥）的治則多以清熱解毒、活血化瘀、通絡(luò)止痛等，具有這些功效的中藥如金銀花、連翹、蒲公英等，被稱(chēng)為“抗炎中藥”。雖然“抗炎中藥”已表現(xiàn)出良好的臨床治療效果，但由于這類(lèi)中藥的抗炎機(jī)制不明確，加上中醫(yī)方劑的變化，使“抗炎中藥”的應(yīng)用受到嚴(yán)重制約。因此，應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)的理論和技術(shù)研究“抗炎中藥”，以明確“抗炎中藥”的抗炎機(jī)制，為“抗炎中藥”能在醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)臨床上廣泛應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
　　本試驗(yàn)根據(jù)中醫(yī)清熱解毒、活血化瘀的治則，擬定

3、中藥方“蒲和飲”。通過(guò)建立小鼠炎癥模型，觀(guān)察中藥方”蒲和飲”對(duì)炎癥模型小鼠的治療效果，并應(yīng)用病理組織學(xué)技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(Real-time Quantitative RT-PCR)技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-LinkedImmuno Sorbent Assay，ELI SA)技術(shù)研究“蒲和飲”的抗炎效果及抗炎固有免疫機(jī)制，以期明確其抗炎作用靶點(diǎn)，為其進(jìn)一步研發(fā)提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.中藥方“蒲

4、和飲”抗炎效果研究
　　為研究中藥方劑“蒲和飲”對(duì)炎癥的抑制效果，本試驗(yàn)通過(guò)建立二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型和10％鮮雞蛋清致小鼠足趾腫脹模型來(lái)研究“蒲和飲”的對(duì)急性炎癥抑制效果，并確定最佳用藥劑量。結(jié)果表明，中藥方劑“蒲和飲”能顯著降低二甲苯炎癥模型小鼠的耳廓腫脹度和腫脹率(P＜0.01);其“蒲和飲”高劑量（160mg/kg）、中劑量（80mg/kg）、低劑量（40mg/kg）組對(duì)小鼠耳廓腫脹抑制率分別為38.01％、48.37％

5、、20.22％。中藥方“蒲和飲”也能顯著降低10％鮮雞蛋清致足趾腫脹模型小鼠的足趾腫脹率，與模型組比較差異極顯著(P＜0.01)，其“蒲和飲”高、中、低劑量組在注射蛋清后4h的腫脹抑制率均達(dá)到最高，分別為44.51％、57.38％、32.39％。結(jié)果提示，中藥方“蒲和飲”對(duì)二甲苯和鮮雞蛋清所致的炎癥具有顯著的抑制作用。
　　2小鼠膿毒癥模型的建立及中藥方”蒲和飲”對(duì)小鼠膿毒癥的干預(yù)效果
　　通過(guò)腹腔注射LPS建立小鼠膿毒癥模

6、型，進(jìn)行“蒲和飲”的干預(yù)試驗(yàn)研究。試驗(yàn)設(shè)立對(duì)照組、模型組和藥物干預(yù)組。觀(guān)察造模后6～72h不同時(shí)間點(diǎn)小鼠的臨床癥狀為:造模6h后小鼠開(kāi)始出現(xiàn)精神沉郁、被毛凌亂、行動(dòng)遲緩、呼吸加快等;剖檢發(fā)現(xiàn)小鼠皮下充血、出血，腸出血，肝臟色澤蒼白、部分可見(jiàn)白色點(diǎn)狀壞死等。使用中藥“蒲和飲”干預(yù)后，LPS膿毒癥小鼠的臨床癥狀和剖檢癥狀較模型組顯著減輕。病理組織學(xué)分析表明，造模12h后，可見(jiàn)小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯變性腫脹，細(xì)胞邊界及細(xì)胞核模糊不清或消失，炎性細(xì)

7、胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞脂肪樣變性，可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，肝竇明顯淤血，48h后，病變情況開(kāi)始逐漸減輕，72h可見(jiàn)較多雙核肝細(xì)胞;使用“蒲和飲”干預(yù)后的，其肝小葉結(jié)構(gòu)較清楚，肝細(xì)胞排列稍微紊亂，少數(shù)肝細(xì)胞發(fā)生輕度變性水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，中央靜脈少許擴(kuò)張有淤血，余未見(jiàn)異常變化。表明中藥方“蒲和飲”對(duì)小鼠LPS膿毒癥具有一定的干預(yù)效果。
　　3“蒲和飲”對(duì)LPS膿毒癥小鼠肝組織中TLR4及下游相關(guān)信號(hào)分子mRNA表達(dá)量的影響
　　分子固有免疫

8、的研究證明，TLR4為L(zhǎng)PS的主要模式識(shí)別受體，可通過(guò)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)途徑引起機(jī)體的免疫反應(yīng)作用。本試驗(yàn)通過(guò)分析TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路中各重要節(jié)點(diǎn)分子表達(dá)量的變化，初步確定“蒲和飲”發(fā)揮抗炎作用的固有免疫機(jī)制并判定該方劑的作用靶標(biāo)。熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)小鼠肝組織中TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-10和HMGB1 mRNA表達(dá)水平的結(jié)果顯示:LPS膿毒癥造模后，LPS膿毒癥

9、小鼠與陰性對(duì)照組比較，TLR4、MyD88、NF-κB等基因mRNA表達(dá)水平均不同程度升高，分別于18、18、18、12、24、24h達(dá)峰值，與陰性對(duì)照組的差異極顯著(P＜0.01)。在使用“蒲和飲”干預(yù)后的12、18、24、24、24h時(shí)間段，“蒲和飲”干預(yù)膿毒癥模型小鼠肝組織中TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、HMGB1 mRNA表達(dá)水平均顯著低于膿毒癥模型組小鼠（P＜0.05或P＜0.01），IL-10的表達(dá)水平均高于

10、模犁組小鼠，36h與模型組比較差異顯著(P＜0.05)。研究表明，“蒲和飲”可能是通過(guò)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，抑制LPS受體TLR4、及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子MyD88、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、促炎細(xì)胞因子TNF-α及晚期炎癥介質(zhì)HMGB1表達(dá)，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)。提示TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路中MyD88、NF-κB等各節(jié)點(diǎn)分子可作為抗炎中藥“蒲和飲”的作用靶標(biāo)。
　　4“蒲和飲

11、”對(duì)LPS膿毒癥小鼠血清TNF-α、IL-10、PGE2、HMGB1含量的影響
　　在研究中藥方“蒲和飲”影響TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路中重要節(jié)點(diǎn)分子mRNA在組織中表達(dá)情況的同時(shí)，本試驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)了不同時(shí)間點(diǎn)小鼠的血清中TNF-α、IL-10、PGE2、HMGB1等重要相關(guān)因子蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，LPS膿毒癥模型小鼠血清中TNF-α、IL-10、PGE2及HMGB1濃度高于陰性對(duì)照組，分

12、別于12h、24h、18h及24h達(dá)峰值。以“蒲和飲”對(duì)膿毒癥模型小鼠干預(yù)治療，“蒲和飲”干預(yù)組小鼠血清中TNF-α含量在12h、24h顯著低于膿毒癥模型組(P＜0.05)，IL-10水平在18h、48h顯著高于膿毒癥模型組(P＜0.05，P＜0.01)，PGE2含量在18h、24h、36h顯著低于膿毒癥模型組(P＜0.01，P＜0.05)，HMGB1水平在24h極顯著低于膿毒癥模型組(P＜0.01)。研究表明，“蒲和飲”可顯著抑制LP