家蠶高血蛋白疾病模型的建立及其對絲腺退化發(fā)育的影響.pdf

1、循環(huán)血液中的蛋白質(zhì)（氨基酸）水平異常是常見的代謝疾病，包括高蛋白血癥和低蛋白血癥。其中因為氨基酸代謝障礙引起的遺傳性氨基酸水平升高疾病已發(fā)現(xiàn)超過100種，然而還缺乏純粹意義的高蛋白血癥疾病相關(guān)病理和治療的報道。其主要原因是目前還無有效的高蛋白血癥動物模型，也缺乏高蛋白血癥動物模型建模方法的報道。為此，本文對無脊椎模式動物家蠶開展了相關(guān)研究。
　　絲腺是家蠶最具特色的器官，在家蠶幼蟲化蛹變態(tài)過程中發(fā)生典型的程序性死亡。對絲腺退化發(fā)育

2、的研究一直受到廣泛地重視。本文在基礎(chǔ)形態(tài)和指標(biāo)測定的基礎(chǔ)上，應(yīng)用BCA方法測定家蠶血淋巴中的總蛋白，高效液相色譜法測定21種氨基酸相對含量。進一步應(yīng)用PT-PCR、qRT-PCR方法調(diào)查了凋亡自噬基因在高血蛋白模型家蠶絲腺中的表達差異，免疫熒光檢測凋亡蛋白Caspase-3表達情況。從細(xì)胞程序性死亡機制視角初步研究了高血蛋白對于絲腺退化異常的影響。主要結(jié)果如下：
　　1.家蠶高血蛋白疾病模型的建立
　　本文使用的家蠶高血蛋白

3、疾病模型的建模方法與原理是，在家蠶幼蟲成熟并停止進食后，破壞或堵塞其頭部前段的吐絲孔，阻止絲腺中儲存蛋白質(zhì)外分泌。破壞或堵塞成熟幼蟲吐絲孔的方法有高溫或低溫激光、高溫燙傷、以及低熔點石蠟或無毒膠水封涂等，本文報道了低熔點石蠟封涂方法的建模結(jié)果。
　　BCA方法測定該高血蛋白模型，9d–11d化蛹期間循環(huán)血總蛋白水平高于對照150-600％。高效液相色譜法測定的蛹期9d–11d期間循環(huán)血中總氨基酸水平高于對照130-200%，其中S

4、er,Gln,Thr,Arg,Val,Trp,Phe和Lys等8種氨基酸含量升高顯著，組氨酸（His）含量顯著降低。丙氨酸、絲氨酸和酪氨酸等幾種絲蛋白質(zhì)高含量的氨基酸疾病模型中合理地高于對照，而絲蛋白中含量33%的甘氨酸，在疾病模型家蠶的循環(huán)血與對照中沒有顯著差異。
　　2.家蠶高血蛋白疾病模型的絲腺組織退化
　　以絲腺組織為靶組織研究的結(jié)果顯示，家蠶高血蛋白疾病模型的絲腺退化過程相對于對照組延長了約120h。HE染色觀察程

5、序性細(xì)胞希望的典型特點。細(xì)胞自噬和凋亡信號通路相關(guān)基因表達水平檢測結(jié)果顯示，高血蛋白疾病模型家蠶的絲腺細(xì)胞中自噬信號基因Atg6和Atg8在家蠶化蛹期間表達上升顯著慢于對照組家蠶。而高血蛋白疾病模型家蠶中凋亡相關(guān)信號基因Dronc在化蛹期間的表達情況與對照組沒有顯著差異。免疫組化實驗結(jié)果顯示，對照家蠶和高血蛋白疾病模型家蠶中啟動細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白Caspase-3在絲腺整個退化過程中都表達。表明高血蛋白疾病模型家蠶絲腺退化延緩可能主要與