15691.脆皮大頭蛙cathelicidins基因克隆、表達(dá)及結(jié)構(gòu)與功能分析

1、碩士學(xué)位論文脆皮大頭蛙Cathelicidins基因克隆、表達(dá)及結(jié)’構(gòu)與功能分析GeneCloning、Expression&StructureandFunctionalCharacterizationofCathelicidinsfromLimnonectesfragilis作者姓j名：學(xué)科、專(zhuān)業(yè)：學(xué)號(hào)：指導(dǎo)教師：王漁室副塾援完成日期：圣Q!圣生墨旦大連理工大學(xué)DalianUniversityofTechnology大連理工大學(xué)碩士學(xué)

2、位論文摘要Cathdiddins是一類(lèi)由N端信號(hào)肽區(qū)域、中間保守eathelin結(jié)構(gòu)域和C端高度特異的成熟肽區(qū)域組成的宿主防御肽家族，是脊椎動(dòng)物自然免疫的關(guān)鍵因子，發(fā)揮著重要的抗微生物感染和病原體入侵效應(yīng)，是連接自然免疫和特異性免疫的橋梁。迄今為止，在自然界幾乎所有脊椎動(dòng)物，包括哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)和低等的魚(yú)類(lèi)中均有發(fā)現(xiàn)，唯獨(dú)在兩棲類(lèi)中幾乎沒(méi)有報(bào)道。在本論文中，我們首次報(bào)道了來(lái)源于兩棲類(lèi)蛙科物種—脆皮大頭娃(Limnonectes肛硒凰

3、)的eathelicidin基因。從所構(gòu)建的脆皮大頭蛙皮膚eDNA文庫(kù)中，首次克隆得到了兩條編碼cathelieidins前體的eDNA核酸序列。序列全長(zhǎng)分別為586bp和596bp，由此推斷出的兩條cathelicidin前體分別由155和151個(gè)氨基酸殘基組成。Blast比對(duì)分析，其結(jié)構(gòu)同樣包括N端信號(hào)肽區(qū)、中間保守的eathelin區(qū)和C端成熟肽區(qū)三部分。進(jìn)化分析表明，兩棲類(lèi)蛙科cathelieidins與爬行類(lèi)(蛇)、鳥(niǎo)類(lèi)(雞、

4、鵪鶉、環(huán)頸雉)來(lái)源的eathelieidins在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中獨(dú)立成簇，與這些物種的進(jìn)化先后順序相吻合，這為eathelieidin基因家族的起源以及結(jié)構(gòu)多樣性和功能分化的進(jìn)化機(jī)制研究，提供了非常有效的補(bǔ)充證據(jù)。對(duì)于不同物種而言，cathelicidin前體的酶切位點(diǎn)不盡相同，而經(jīng)蛋白酶作用后釋放出來(lái)的成熟肽序列更是千差萬(wàn)另IJ。比對(duì)后，根據(jù)eathelin區(qū)域中彈性蛋白酶(哺乳動(dòng)物eathelieidin家族常見(jiàn)酶切位點(diǎn)，Val)和胰蛋

5、白酶酶切位點(diǎn)(蛙類(lèi)抗茵肽家族常見(jiàn)酶切位點(diǎn)，LysArg或姆Arg)分別對(duì)這兩條前體肽中成熟肽的序列進(jìn)行了預(yù)測(cè)，所推斷的四條成熟肽分別命名為L(zhǎng)fCATHl／2與LfCATHl以a?；瘜W(xué)合成LfCATHl／2成熟肽，進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)40種測(cè)試菌株均沒(méi)有抑菌活性。而經(jīng)大腸桿菌原核表達(dá)的LfCATHla成熟肽，藥敏實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌圈。合成的Lf：CATHla對(duì)所測(cè)試的金黃色葡萄球菌ATCC25923、IS090223、I

6、Sl307、和大腸桿菌ATCC25922表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，且LfCATHla溶血活性和凝集素活性均不明顯。以上結(jié)果說(shuō)明依據(jù)胰蛋白酶酶切位點(diǎn)釋放成熟肽的可能性較大。除此以外，LfCATHla還具有較強(qiáng)的抗氧化性，對(duì)DPPH自由基的清除率為5779％。鑒于兩棲類(lèi)復(fù)雜的生存環(huán)境，以上結(jié)果表明LfCATHla在宿主復(fù)雜的免疫機(jī)制中不僅起到抗微生物感染作用，而且還可能發(fā)揮了其他重要功能，如抗氧化以保護(hù)兩棲類(lèi)裸露的皮膚等。關(guān)鍵訶：脆皮大頭蛙；C