互花米草SaP5CS基因的克隆及功能研究和灌漿期干旱對小麥產(chǎn)量的影響.pdf

1、土壤鹽漬化和干旱是兩種影響植物生長較為常見的非生物脅迫，最終導(dǎo)致植物死亡以及作物產(chǎn)量的減少。高鹽脅迫可擾亂植物體內(nèi)水勢與離子分布的平衡，引起細(xì)胞內(nèi)形成高滲信號，使植物體產(chǎn)生應(yīng)對脅迫的響應(yīng)，植物細(xì)胞通過拒鹽、Na+區(qū)域化、滲透調(diào)節(jié)等應(yīng)答機(jī)制減少鹽漬化的傷害。干旱破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響光合作用，造成作物產(chǎn)量下降，形態(tài)變化和滲透調(diào)節(jié)是植物主要的抗旱機(jī)制。滲透調(diào)節(jié)過程是植物適應(yīng)逆境機(jī)制之一，克隆參與其過程中的關(guān)鍵基因并研究其功能，有助于深入了解

2、植物的耐逆應(yīng)答機(jī)制，并通過轉(zhuǎn)基因方法培育轉(zhuǎn)基因植物，提高土地利用效率。
　　本實(shí)驗(yàn)以泌鹽鹽生植物互花米草（Spartina alterniflora Loisel）為材料，克隆并分析了編碼合成脯氨酸的關(guān)鍵酶—吡咯啉-5-羧酸合成酶（pyrroline-5-carboxylatesynthetase,P5CS）基因—SaP5CS在脅迫下的表達(dá)變化。其次，通過將構(gòu)建的SaP5CS基因植物過量表達(dá)載體和亞細(xì)胞定位融合基因表達(dá)載體進(jìn)行異源

3、表達(dá)，對獲得的純合轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行分子鑒定、耐鹽性分析和SaP5CS基因表達(dá)產(chǎn)物在煙草葉片中的定位觀察，初步分析了SaP5CS基因在互花米草在應(yīng)答鹽脅迫中的作用。在此基礎(chǔ)上主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　?。?）互花米草幼苗SaP5CS基因表達(dá)量和脯氨酸含量在高鹽和模擬干旱下升高。
　　在鹽處理及PEG處理下SaP5CS基因在葉中表達(dá)量及脯氨酸的積累量分別在400mmol/L NaCl和10％PEG處理下出現(xiàn)高峰。
　?。?）互

4、花米草SaP5CS基因的克隆及序列分析利用RACE的方法克隆得到SaP5CS基因全長序列，全長序列共2648bp，編碼729個氨基酸，SaP5CS基因與高粱（sorghum bicolor）P5CS基因同源性最高。
　?。?）SaP5CS表達(dá)產(chǎn)物亞細(xì)胞定位分析將融合基因表達(dá)載體在煙草葉片瞬時表達(dá)，初步確定SaP5CS在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)并在細(xì)胞膜附近聚集。
　?。?）SaP5CS基因異源過量表達(dá)研究通過篩選得到了7個過量表達(dá)SaP

5、5CS的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，通過Real-timePCR分析SaP5CS基因在擬南芥中表達(dá)量的差異。在不同濃度 NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株的耐鹽性有所提高，脯氨酸含量明顯增加，葉片中活性氧積累有所減少。
　　干旱造成的傷害嚴(yán)重影響作物最終的產(chǎn)量。小麥?zhǔn)俏覈蠹Z食作物之一，在我國國民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)重要地位。灌漿期是小麥發(fā)育的重要階段，在此生長時期，葉片當(dāng)中的主要光合產(chǎn)物（碳水化合物），以蔗糖的形式向籽粒中轉(zhuǎn)移，并在籽粒中不斷

6、積累。此時當(dāng)水分供給不充分，細(xì)胞失水，造成干旱脅迫，植物體內(nèi)同化物的轉(zhuǎn)運(yùn)與分配及庫源關(guān)系也發(fā)生了顯著變化。
　　本實(shí)驗(yàn)以我國黃淮海小麥主產(chǎn)區(qū)大面積推廣的干旱小麥品種煙農(nóng)21和高肥水品種濟(jì)麥22為材料，通過灌漿期之前停止水分供給，模擬干旱，并在灌漿期不同階段進(jìn)行復(fù)水處理，研究了干旱對旗葉生理指標(biāo)，光合產(chǎn)物（蔗糖）合成及其對最終產(chǎn)量的影響；分析了干旱應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：（1）灌漿期旗葉生理指標(biāo)測定在灌漿初期

7、，煙農(nóng)21處理組超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）和抗壞血酸過氧化物酶（Aseorbate peroxidase,APX）的活性高于對照組。而濟(jì)麥22處理組葉片中SOD和APX活性對照組顯著降低。不同時間復(fù)水后，煙農(nóng)21植株各種酶活力變化與濟(jì)麥22相似。兩品種中旗葉葉綠素含量在灌漿期隨著葉片的衰老緩慢降低。與濟(jì)麥22相比，煙農(nóng)21號中脯氨酸的含量在干旱脅迫下快速積累。
　?。?）灌漿期旗葉相關(guān)基因的

8、表達(dá)分析蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase,SPS）在灌漿初期和中期表達(dá)水平緩慢升高，在灌漿后期迅速上升。而兩個小麥品種中的耐逆基因如脫水素（dehydrins,DHN），P5CS，甜菜堿醛脫氫酶（betaine aldehyde dehydragenase,BADH）在煙農(nóng)21中表達(dá)水平在復(fù)水前后均表現(xiàn)出較大差異。
　　（3）灌漿期干旱處理小麥產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)煙農(nóng)21與濟(jì)麥22在正常土壤水分情況下每穗的