從寄主昆蟲血淋巴中獲取病原真菌菌體的方法研究.pdf

1、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）是一類應(yīng)用廣泛的昆蟲病原真菌，在昆蟲防治中起著重要作用。與化學(xué)農(nóng)藥相比，盡管真菌殺蟲劑安全，無(wú)環(huán)境污染，但卻存在著殺蟲速率緩慢的弱點(diǎn)，這在很大程度上阻礙了真菌殺蟲劑的應(yīng)用。昆蟲病原真菌致病機(jī)制的研究可為發(fā)展新型高效真菌殺蟲劑提供依據(jù)。真菌突破昆蟲表皮障礙侵入寄主血淋巴后，病原真菌侵入昆蟲體后主要在血腔內(nèi)生長(zhǎng)增殖，以蟲菌體等形式存在于寄主體內(nèi)血淋巴中，直到寄主死亡。多數(shù)昆蟲病原真

2、菌能夠迅速穿透昆蟲體壁，通常在24小時(shí)左右就能夠侵入寄主體內(nèi)，但是，需要一周甚至更長(zhǎng)的時(shí)間才能使昆蟲致死。因此，研究病原真菌在侵入昆蟲體內(nèi)后使寄主致死的機(jī)制具有重要意義。弄清病原真菌在侵入昆蟲體內(nèi)后的基因表達(dá)情況是致病機(jī)制研究的重要內(nèi)容。從感病昆蟲體內(nèi)直接獲取病原真菌菌體，以分離和克隆綠僵菌侵入蝗蟲體內(nèi)后表達(dá)的基因，對(duì)于研究它們?cè)谥虏C(jī)理中的作用具有非常重要的意義。 本文采用正交實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)東亞飛蝗（Locusta migrat

3、oria）血細(xì)胞裂解及其DNA和RNA降解的條件進(jìn)行了優(yōu)化。在優(yōu)化條件下，不僅去除了感病東亞飛蝗血淋巴中的血細(xì)胞及DNA和RNA，而且成功地分離和純化了綠僵菌(Metarhizium anisopliae)菌體。為后續(xù)分離和克隆綠僵菌在蝗蟲體內(nèi)表達(dá)的基因，研究它們?cè)谥虏C(jī)理中的作用奠定了基礎(chǔ)。 主要研究結(jié)果如下： 1.對(duì)蝗蟲引物及綠僵菌引物進(jìn)行PCR靈敏度分析。結(jié)果為：蝗蟲特異引物1、2能檢測(cè)出0.1pg的蝗蟲DNA，綠

4、僵菌特異性引物3、4能檢測(cè)出1pg綠僵菌DNA。 2.通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)東亞飛蝗（Locusta migratoria）血細(xì)胞裂解及其DNA和RNA降解的條件進(jìn)行了優(yōu)化，得出最佳酶解條件為：蛋白酶K的濃度為1mg/ml，作用溫度為26℃，時(shí)間為60min，脫氧核糖核酸酶(DNAase I)的用量為5U，核糖核酸酶(RNAase A)的濃度為0.5mg/ml，核酸酶作用時(shí)間為35min，溫度為30℃。 3.根據(jù)正交試驗(yàn)