中國禽類衣原體多樣性及Chlamydia gallinacea基因組學(xué)研究.pdf

1、衣原體（Chlamydia spp.）為一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性菌，具有原體和始體兩個獨(dú)特的發(fā)育周期，在自然界廣泛存在，可引起多種動物和人類的衣原體病。衣原體科包含1個衣原體屬，下設(shè)11個種:肺炎衣原體、沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、流產(chǎn)衣原體、家畜衣原體、鼠衣原體、豬衣原體、貓衣原體、豚鼠衣原體，以及2014年新確定的Chlamydiaavium（C.avium）和Chlamydia gallinacea(C.gallinacea)。

2、衣原體感染對畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，同時還對動物產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易和人類健康等公共衛(wèi)生安全領(lǐng)域產(chǎn)生重要影響。
　　鸚鵡熱衣原體長期被認(rèn)為是禽衣原體病的主要病原，我國禽類衣原體的流行病學(xué)資料十分有限，世界范圍內(nèi)對衣原體新種(C.avium和C.gallinacea)的致病性和基因組學(xué)的信息知之甚少。本課題系統(tǒng)研究中國禽類（雞、鴨、鵝和鴿）中的衣原體存在和流行現(xiàn)狀，并對C.gallinacea的分離菌株開展致病性和基因組學(xué)研究。

3、r>　　一、檢測11個衣原體種FRET-qPCR方法的建立
　　衣原體的檢測方法主要包括病原分離培養(yǎng)、直接染色鏡檢、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinked immunosorbent assay，ELI SA)、間接血凝試驗(yàn)(indirect haemagglutination test，IHA)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixation test，CFT)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain rea

4、ction，PCR)等。其中病原分離培養(yǎng)是衣原體檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時較長、靈敏度有限;ELISA方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，但會與其它微生物之間發(fā)生交叉反應(yīng);IHA和CFT方法對設(shè)備要求低，但操作繁瑣，靈敏度不高。血清學(xué)方法經(jīng)常適用于批量樣品的檢測，但無法區(qū)分免疫接種和自然感染，可能造成假陽性。
　　隨著衣原體檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，新型分子生物學(xué)方法是檢測衣原體新的發(fā)展趨勢。用于檢測衣原體的PCR方法很多，包括普通PCR、多重PCR、巢

5、氏PCR、熒光定量PCR等。熒光定量PCR方法是一種特異性強(qiáng)和靈敏度高的實(shí)時定量檢測特定核酸技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于多個衣原體種的檢測，如肺炎衣原體、沙眼衣原體、鸚鵡熱衣原體、流產(chǎn)衣原體、家畜衣原體、貓衣原體等。目前已建立的PCR方法一般是針對某一個或幾個衣原體種，但不能同時檢測11個衣原體種。因此，本研究主要基于衣原體23S rRNA基因序列，建立了一種能同時檢測11個衣原體種的FRET-qPCR方法;根據(jù)11個衣原體種產(chǎn)生熔解溫度的不同而

6、將其區(qū)分為8個組別，并對熔解溫度接近的衣原體種進(jìn)行測序證實(shí)。該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，是世界范圍首次建立能同時檢測并大致區(qū)分11個衣原體種的熒光定量PCR方法。
　　二、中國禽類衣原體多樣性研究
　　本研究采集了全國24省活禽市場2，300個健康家禽的3，962份咽拭子和泄殖腔拭子，其中雞、鴨、鵝和鴿的數(shù)量分別為1，791、179、115和215;咽拭子和泄殖腔拭子均采集的家禽有1，662個，僅采集咽拭子的有476個，僅采集

7、泄殖腔拭子的有162個。應(yīng)用本研究建立的衣原體FRET-qPCR方法進(jìn)行檢測，結(jié)合熔解曲線和測序分析鑒別衣原體種。研究表明，家禽中的衣原體總陽性率為26.2％(602/2，300)，其中鴿的衣原體陽性率最高，達(dá)到49.3％(106/215)，然后依次為雞(24.7％，442/1,791)、鴨(24.0％，43/179)、鵝(9.6％，11/115)。不同地區(qū)衣原體陽性率差異較大，高于30％的有9個省份，四川省為最高，達(dá)到80.0％(56

8、/70);沒有檢出衣原體的5個省份包括山西、西藏、吉林、遼寧、上海;其它10個省份的衣原體陽性率為1.0％-26.0％。衣原體在咽拭子中的陽性率為22.0％，顯著高于泄殖腔拭子中衣原體的陽性率16.1％;咽拭子和泄殖腔拭子均采集的家禽中衣原體陽性率為27.3％，其中兩種拭子均陽性的家禽有162個，包括142個相同衣原體感染和20個雙重感染。
　　本研究從中國家禽中檢測出5個衣原體種:C.gallinacea、鸚鵡熱衣原體、家畜衣原

9、體、豬衣原體和鼠衣原體。其中C.gallinacea和鸚鵡熱衣原體為禽類主要的衣原體流行種，均從4種家禽中檢出，前者占陽性家禽的61.7％(384/622)，且主要來源于雞，后者占陽性家禽的24.0％(149/622)，但多數(shù)來源于鴿;家畜衣原體陽性樣品僅3個，并且均來源于內(nèi)蒙古地區(qū)雞的咽拭子;豬衣原體和鼠衣原體分別占陽性家禽的10.5％(65/622)和3.4％(21/622)。本研究在世界范圍首次從禽類檢測出豬衣原體和鼠衣原體，并報(bào)

10、道C.gallinacea為家禽的衣原體流行種，而鸚鵡熱衣原體是鴿的衣原體流行種。
　　三、三黃雞自然感染衣原體的動態(tài)監(jiān)測
　　中國禽類衣原體多樣性研究表明活禽市場的健康家禽可感染多個衣原體種，并且發(fā)現(xiàn)江西新干縣某山村的三黃雞攜帶4個衣原體種:鸚鵡熱衣原體、C.gallinacea、豬衣原體和鼠衣原體。本研究對該地區(qū)的三黃雞進(jìn)行7個月的衣原體動態(tài)監(jiān)測，分為9次采樣:第1-3次在江西新干縣某山村;隨后雞群轉(zhuǎn)運(yùn)至江蘇省家禽科學(xué)研

11、究所動物房，并進(jìn)行第4-9次采樣。第1-2次檢測發(fā)現(xiàn)三黃雞中衣原體陽性率分別為74.4％(35/47)和40.9％(36/88);第3次檢測后選取31只衣原體陽性的雞轉(zhuǎn)運(yùn)至江蘇省家禽科學(xué)研究所飼養(yǎng):豬衣原體的陽性率達(dá)90.3％(28/31)，其次為鸚鵡熱衣原體6.5％(2/31)和C.gallinacea3.2％(1/31)。第1-3次采樣檢測共發(fā)現(xiàn)4個衣原體種，其中豬衣原體為主要流行種，分別占衣原體陽性雞的88.6％(31/35)、8

12、3.3％(30/36)、90.3％(28/31)。
　　雞群轉(zhuǎn)運(yùn)至江蘇省家禽科學(xué)研究所動物房后，第4-5次檢測表明衣原體的陽性率顯著下降;第6-9次檢測發(fā)現(xiàn)，豬衣原體和鸚鵡熱衣原體完全消失，而C.gallinacea逐漸成為主要流行種，并且是唯一能檢測到的衣原體種，這種感染狀態(tài)一直持續(xù)到動態(tài)監(jiān)測結(jié)束。此外，隨機(jī)選取5只C.gallinacea陽性的雞進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)血液、咽拭子、泄殖腔拭子，以及7種臟器（氣管、心臟、肝臟、脾臟、肺臟

13、、腎臟、胰腺）均可檢測到C.gallinacea的存在。本研究動態(tài)監(jiān)測結(jié)果表明，豬衣原體和鸚鵡熱衣原體隨著周圍環(huán)境的改變而逐步消失，但C.gallinacea陽性率上升并成為主要流行種。據(jù)此推測，三黃雞感染豬衣原體和鸚鵡熱衣原體可能只是暫時性的，而C.gallinacea很可能是雞這種自然宿主的共宿體。
　　四、Chlamydia gallinacea的分離鑒定及ompA基因的多態(tài)性分析
　　本研究利用Hep-2細(xì)胞從C.e

14、gallinacea陽性的三黃雞的1份咽拭子和3份泄殖腔拭子成功分離到4株C.gallinacea(JX-1、JX-2、JX-3、JX-4)。分離株的主要外膜蛋白A(ompA)基因序列經(jīng)比對分析一致（GenBank登錄號:KT692977），并且與C.gallinacea08-1274/3株相應(yīng)序列的相似度為85.7％(GenBank登錄號:AWUS01000004)。
　　本研究檢測為C.gallinacea陽性的拭子樣品分別進(jìn)

15、行ompA基因可變區(qū)1-2和可變區(qū)3-4的PCR擴(kuò)增及測序，將測序結(jié)果分別與GenBank中ompA基因序列進(jìn)行多重比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，C.gallinacea的ompA基因具有豐富的多態(tài)性，除GenBank已收錄的ompA基因序列外，至少還存在13個新的血清型。目前，世界范圍內(nèi)僅僅從法國成功分離了1株C.gallinacea;本研究從江西新干縣的三黃雞中分離到4株C.gallinacea，新病原的分離鑒定將對深入研究C

16、.gallinacea的致病性、宿主范圍、傳播機(jī)制以及潛在的人畜共患性意義重大。
　　五、Chlamydia gallinacea對雞胚致病性和肉雞增重的影響
　　本研究利用C.gallinaceaJX-1株分別接種SPF雞胚和AA肉雞，觀察其對雞胚致病性和AA肉雞增重的影響。雞胚接種試驗(yàn)分為3個感染組和1個對照組，每組均為5個雞胚。7日齡時，感染組接種200μl不同濃度的C.gallinacea（高、中、低劑量組分別為10

17、5、104、103基因組/μl），對照組接種200μl的SPG緩沖液，接種途徑均為卵黃囊接種。結(jié)果在10到18日齡期間感染組雞胚全部死亡，但死亡時間不規(guī)律，其中高劑量組雞胚的病變較為嚴(yán)重，表現(xiàn)為胚體卷曲呈球形，全身出血，肝臟出血壞死、心外膜出血、腸道出血;經(jīng)FRET-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)雞胚卵黃膜、卵黃和尿囊液均有不同程度的C.gallinacea感染，其中卵黃膜含量最高(2×107基因組/mg)，然后依次為卵黃（4×103基因組/μl）和

18、尿囊液(2×103基因組/μl)，而對照組的5個雞胚均能正常生長發(fā)育至孵化出殼。
　　將C.gallinaceaJX-1株滴鼻方式接種于7日齡AA肉雞，劑量為20μl(105基因組/μl)。結(jié)果表明，感染組和對照組沒有任何臨床癥狀。7日齡AA肉雞在接種前采集的拭子經(jīng) FRET-qPCR檢測均為陰性，兩組之間體重沒有顯著差異;接種后前兩周，感染組和對照組體重仍沒有顯著差異;而接種后第3到第5周，感染組體重顯著低于對照組(883±54

19、[SEM]vs.962±61g，1，165±80vs.1，315±93g，1，539±120g vs.1，645±133g)。接種后前兩周，感染組每周增重率比對照組分別降低2.9％和5.2％，差異不顯著;但接種后第3到第5周感染組每周增重率比對照組顯著降低(8.2％，11.4％，6.5％;P＜0.0009)。由此可見，C.gallinacea JX-1株對雞胚有一定致病性，感染肉雞雖不表現(xiàn)臨床癥狀，但對肉雞的增重有顯著影響。
　　

20、六、Chlamydia gallinacea JX-1株的全基因組測序及比較基因組學(xué)分析
　　本研究對新分離的C.gallinacea.JX-1株采用第三代測序技術(shù)進(jìn)行全基因組測序。由此，我們獲得了世界范圍第2個C.gallinacea全基因組序列。C.gallinacea JX-1株基因組大小為1.05Mbp，GC含量為37.93％;預(yù)測有957個基因，占基因組大小的91.21％; ncRNA包括39個tRNA，2個5S rRN

21、A，1個16S rRNA，1個23S rRNA;有24個串聯(lián)重復(fù)序列和37個散在重復(fù)序列;有1個10，815bp的基因島;沒有發(fā)現(xiàn)前噬菌體、短回文重復(fù)序列以及次級代謝基因簇結(jié)構(gòu)。
　　C.gallinacea JX-1株通過與權(quán)威數(shù)據(jù)庫比對分析，獲得編碼基因及其對應(yīng)產(chǎn)物的功能注釋。GO數(shù)據(jù)庫有625個基因，KEGG數(shù)據(jù)庫有576個基因，COG數(shù)據(jù)庫有644個基因，Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫有469個基因。分泌蛋白的預(yù)測結(jié)果有26個

22、，分泌系統(tǒng)蛋白預(yù)測有6個Ⅱ型分泌系統(tǒng)(T2SS)蛋白和39個Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS)蛋白，TTSS效應(yīng)蛋白的預(yù)測結(jié)果有61個，其中2個效應(yīng)蛋白編碼基因GM000184和GM000192位于基因島區(qū)域內(nèi)。PHI數(shù)據(jù)庫共篩選到17個表型突變基因，其中12個與毒力降低相關(guān)，1個毒力基因GM000417與致病性丟失有關(guān)。VFDB數(shù)據(jù)庫中注釋的38個毒力因子中有29個屬于Ⅲ型分泌系統(tǒng)蛋白，1個屬于Ⅱ分泌系統(tǒng)蛋白，其它毒力因子與C.gallinac

23、ea參考基因組序列基本一致。與11個衣原體種的比較基因組學(xué)分析表明，C.gallinacea JX-1株99.99％的比對區(qū)域與C.gallinacea參考株99.29％的比對區(qū)域相似度為99.33％-99.58％，C.gallinaceaJX-1株96.85％的比對區(qū)域與C.avium97.97％的比對區(qū)域之間相似度為53.06％-88.68％，但其與另外9個衣原體種的比對區(qū)域均低于40％，相似度為5.56％-37.24％，差異較大。

24、所以，C.gallinacea JX-1株與C.gallinacea參考株基因組之間的共線性關(guān)系最好，親緣關(guān)系最近，但與C.gallinacea參考基因組的結(jié)構(gòu)變異分析發(fā)現(xiàn)，C.gallinaceaJX-1株有1個126bp的插入序列和1個大片段復(fù)雜的插入缺失區(qū)域;另外，更重要的發(fā)現(xiàn)是，C.gallinacea JX-1株的有些毒力因子與脆弱擬桿菌相似度極高，甚至完全一致，這說明不同物種進(jìn)化過程中形成共有的毒力因子，在致病性方面發(fā)揮重要

25、作用。
　　綜上所述，衣原體是一種可引起多種動物和人類感染的人畜共患病病原，在世界范圍普遍存在，宿主范圍廣泛，但由于臨床表現(xiàn)大多數(shù)不明顯而未能引起足夠重視。長期以來鸚鵡熱衣原體被認(rèn)為是禽衣原體病的主要衣原體種，但本研究從家禽中檢測出5個衣原體種，完全改變了這種觀點(diǎn)，其中C.gallinacea是禽類主要的衣原體流行種，在世界范圍內(nèi)首次報(bào)道從禽類檢測出豬衣原體和鼠衣原體。我們成功地從三黃雞的咽拭子和泄殖腔拭子中分離出4株C.gall

26、inacea(JX-1、JX-2、JX-3、JX-4)。動物試驗(yàn)結(jié)果表明，C.gallinaceaJX-1株對雞胚具有一定的致病性，并顯著降低肉雞增重率高達(dá)11.4％。此外，本研究采用第三代測序技術(shù)獲得C.gallinacea JX-1株全基因組序列，也是世界范圍第2個C.gallinacea全基因組序列，其基因組結(jié)構(gòu)與僅有的1株C.gallinacea基本一致，但SV分析發(fā)現(xiàn)1個126bp的插入序列和1個大片段復(fù)雜的插入缺失區(qū)域;更重