動(dòng)物衣原體分子檢測(cè)方法研究和診斷試劑盒的研制及應(yīng)用.pdf

1、衣原體病是由各類(lèi)衣原體感染人類(lèi)、哺乳動(dòng)物、禽類(lèi)以及節(jié)肢昆蟲(chóng)所引起的一類(lèi)重要疾病，有些衣原體病為人畜共患傳染病。衣原體革蘭氏染色陰性，嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生。目前，衣原體科分為衣原體和嗜衣原體兩個(gè)屬。衣原體屬包括沙眼衣原體、鼠衣原體、豬衣原體；嗜衣原體屬包括肺炎嗜衣原體、家畜嗜衣原體、鸚鵡熱嗜衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體、豚鼠嗜衣原體和貓嗜衣原體。衣原體引起人類(lèi)和動(dòng)物多種疾病，沙眼衣原體、肺炎嗜衣原體和鸚鵡熱嗜衣原體感染人類(lèi)及各種動(dòng)物；家畜嗜衣原體、流產(chǎn)

2、嗜衣原體和豬衣原體主要感染家畜和某些野生動(dòng)物。因此，本病具有十分重要的公共衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)意義，建立快速準(zhǔn)確的鑒別診斷方法對(duì)衣原體病預(yù)防和控制尤為重要。
　　 本論文基于衣原體的主要外膜蛋白基因(ompA)開(kāi)發(fā)針對(duì)豬衣原體(C.suis)、流產(chǎn)嗜衣原體(Ch.abortus)及肺炎嗜衣原體(Cpn)的多重套式PCR(nested multiplex polymerase chain reaction assay，nmPCR)檢測(cè)方法及

3、試劑盒，衣原體熒光定量PCR檢測(cè)方法和LAMP檢測(cè)方法。并應(yīng)用nmPCR試劑盒對(duì)青海某羊場(chǎng)和重慶地區(qū)種豬場(chǎng)進(jìn)行了衣原體病的流行病學(xué)研究。獲得以下研究結(jié)果：
　　 (1)本文建立了衣原體科特異PCR檢測(cè)方法以及流產(chǎn)嗜衣原體、豬衣原體和肺炎嗜衣原體的單管同步分型的多重套式PCR(nmPCR)檢測(cè)方法。在nmPCR首輪擴(kuò)增中，可以擴(kuò)增出衣原體科特異性的1100 bp核酸片段。在此基礎(chǔ)上，第二輪nmPCR擴(kuò)增獲得種特異性擴(kuò)增片段：流產(chǎn)嗜

4、衣原體340 bp，豬衣原體526 bp和肺炎嗜衣原體267 bp。該方法具有靈敏度高和特異性的特點(diǎn)，與改良DNA提取方法相結(jié)合，可以有效實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物、豬、綿羊和山羊鼻咽拭子、糞拭子及組織樣品中三種衣原體同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。
　　 (2)本文研發(fā)了與豬衣原體、流產(chǎn)嗜衣原體及肺炎嗜衣原體的單管同步分型的多重套式PCR檢測(cè)方法相匹配的標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)試劑。通過(guò)穩(wěn)定性試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證試驗(yàn)，證明了該檢測(cè)試劑盒具有良好穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

5、　　 (3)本研究建立了衣原體的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，靈敏度高，特異性強(qiáng)。最低可以檢測(cè)200拷貝/μL質(zhì)粒DNA，可用于衣原體的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
　　 (4)本文基于ompA基因，建立了衣原體科LAMP檢測(cè)方法。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高及實(shí)驗(yàn)條件要求較低的特點(diǎn)，可以在水浴鍋中完成，在添加了鈣黃綠素后，陽(yáng)性的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)呈現(xiàn)明顯的黃綠色，使檢測(cè)結(jié)果的非常直觀，容易判讀。本法適宜于臨床上對(duì)衣原體病進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速篩查，但