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1、近年來,赤潮在世界各地海域頻繁爆發(fā),且規(guī)模不斷擴(kuò)大,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,并危害了人類的生存環(huán)境。亞歷山大藻(Alexandrium)是一種全球分布的常見赤潮藻種,其屬下的30余種甲藻約一半為有毒種類,進(jìn)行亞歷山大藻發(fā)生及防治的研究對(duì)于由其引發(fā)的赤潮的防治具有重要意義。 人們己對(duì)誘發(fā)亞歷山大藻赤潮發(fā)生的環(huán)境因子做了一些研究,這些研究多集中在營(yíng)養(yǎng)鹽(氮、磷等)對(duì)亞歷山大藻增殖的影響上,隨著研究的深入,人們開始重視微量重金屬元素(鐵
2、、錳等)對(duì)藻增殖的影響。殺滅赤潮生物的主要方法有粘土法、化學(xué)藥劑法等。利用硫酸銅治理赤潮曾是國(guó)內(nèi)外長(zhǎng)期采用的方法,但直接利用硫酸銅易造成局部濃度過高,進(jìn)而對(duì)非赤潮生物及海洋生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不利影響。目前國(guó)際上公認(rèn)的一種治理赤潮方法是撒播粘土法,在過去25年中,許多國(guó)家對(duì)其進(jìn)行了研究。盡管粘土被人們視為是一種有效且有發(fā)展?jié)摿Φ目刂瞥喑狈椒?,但粘土的局部不適用、高昂的運(yùn)輸費(fèi)用以及短效性,使得這種方法的應(yīng)用受到了限制。因此,尋找新型殺藻劑并研究其
3、殺藻效果及殺藻機(jī)制意義重大。 本研究以亞歷山大藻LC3為研究材料,對(duì)其發(fā)生赤潮條件進(jìn)行初步研究,并利用電鏡技術(shù)、雙向電泳技術(shù)及質(zhì)譜技術(shù)對(duì)新型殺藻劑的殺藻機(jī)制進(jìn)行研究。 (1)利用正交試驗(yàn)研究氮、磷、鐵、錳四種物質(zhì)對(duì)亞歷山大藻LC3生長(zhǎng)的影響,比較無機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽及微量金屬元素對(duì)亞歷山大藻LC3增殖影響的大小順序。結(jié)果顯示,無機(jī)氮對(duì)藻的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,882~2646μmol/L濃度時(shí)亞歷山大藻LC3生長(zhǎng)較好,2646μmol/
4、L下生長(zhǎng)速率略快。無機(jī)磷對(duì)亞歷山大藻LC3生長(zhǎng)的影響差異顯著,一定濃度的磷對(duì)LC3的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。鐵及錳對(duì)藻生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用,分別在3.5μg/L的鐵濃度下及18~36μg/L的錳濃度下藻可獲得較快的生長(zhǎng)速率。四種元素對(duì)亞歷山大藻LC3生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用,各元素對(duì)生長(zhǎng)影響的大小順序依次為:磷>錳>氮>鐵。 (2)為尋找新型有效的殺藻劑,對(duì)辣椒素、過碳酸鈉、硫酸銅、谷氨酸銅對(duì)亞歷山大藻LC3的殺滅效果以及表面活性劑(HDTMAB)
5、對(duì)谷氨酸銅殺藻的促進(jìn)作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明,辣椒素在較低濃度下(0.1,1.0,10.0mg/ml)對(duì)亞歷山大藻LC3無明顯殺滅作用,達(dá)到殺藻的目的所需辣椒素量較大;過碳酸鈉對(duì)亞歷山大藻LC3的殺滅率偏低,為此認(rèn)為這兩種物質(zhì)均不適宜用于赤潮防治。谷氨酸銅可有效殺滅亞歷山大藻LC3,其對(duì)亞歷山大藻LC3的滅殺效率優(yōu)于硫酸銅,優(yōu)勢(shì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而明顯,但其對(duì)藻的抑制作用并不隨谷氨酸銅的濃度加大而增強(qiáng)。HDTMAB可有效促進(jìn)谷氨酸銅殺滅亞歷山大藻
6、LC3,促進(jìn)作用基本隨著HDTMAB濃度的提高而逐步增強(qiáng)。谷氨酸銅和HDTMAB復(fù)合劑可有效去除亞歷山大藻LC3,在赤潮治理中將具有較好的應(yīng)用前景。 (3)借助掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM),對(duì)谷氨酸銅、HDTMAB、硫酸銅以及谷氨酸銅-HDTMAB協(xié)同作用下亞歷山大藻LC3細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行研究。結(jié)果表明,谷氨酸銅、HDTMAB、硫酸銅或協(xié)同脅迫下,藻的質(zhì)膜(細(xì)胞膜、葉綠體膜、線粒體膜等)完整性遭
7、到了破壞,這表明質(zhì)膜是這些脅迫物質(zhì)攻擊的目標(biāo)。谷氨酸銅、HDTMAB等脅迫物嚴(yán)重破壞了葉綠體、線粒體等的結(jié)構(gòu),這些變化直接影響了亞歷山大藻LC3的呼吸及光合作用,抑制了該藻的生長(zhǎng),甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。銅離子脅迫下,亞歷山大藻LC3細(xì)胞內(nèi)淀粉顆粒、脂質(zhì)體等數(shù)量增加,在液泡、細(xì)胞核以及細(xì)胞膜等部位觀察到了不透明黑色沉淀,這些物質(zhì)可能與藻細(xì)胞解除金屬毒性有關(guān)。 (4)對(duì)谷氨酸銅對(duì)亞歷山大藻LC3細(xì)胞膜透性、丙二醛(MDA)及巰基含量的影
8、響進(jìn)行研究,并比較谷氨酸銅和HDTMAB復(fù)合作用時(shí),不同濃度表面活性劑作用下藻細(xì)胞膜脂過氧化水平、細(xì)胞膜功能狀態(tài)及巰基含量的變化,以對(duì)谷氨酸銅和HDTMAB殺滅赤潮藻的機(jī)制進(jìn)行初步探討。結(jié)果表明,谷氨酸銅對(duì)亞歷山大藻LC3的殺滅主要靠銅離子的毒性作用,且谷氨酸可以增加銅離子穿透細(xì)胞膜的能力,0.5×10-3mol/L谷氨酸銅可促使藻細(xì)胞MDA含量與細(xì)胞質(zhì)膜透性明顯升高,使巰基含量下降,這表明谷氨酸銅殺滅赤潮藻的機(jī)制是使藻細(xì)胞膜受到損傷,
9、膜的透性增大,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)大量外滲,進(jìn)而抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)。HDTMAB可有效促進(jìn)谷氨酸銅殺滅有害赤潮藻,其作用機(jī)理是由于與細(xì)胞膜結(jié)合,增加膜透性,使細(xì)胞膜功能受到破壞。谷氨酸銅、HDTMAB脅迫下,這些生理指標(biāo)的變化驗(yàn)證了透射電鏡觀察的結(jié)果,即谷氨酸銅、HDTMAB作用于亞歷山大藻LC3時(shí)攻擊質(zhì)膜,使質(zhì)膜遭到破壞的結(jié)論。 (5)用HDTMAB和Ca2+復(fù)合作用殺滅亞歷山大藻LC3,對(duì)Ca2+在HDTMAB殺滅亞歷山大藻LC3過程中的
10、作用進(jìn)行初步研究。比較不同濃度Ca2+對(duì)HDTMAB殺滅亞歷山大藻LC3的影響,結(jié)果表明,Ca2+可明顯抑制HDTMAB對(duì)亞歷山大藻LC3的殺滅,濃度為4mmol/L時(shí)Ca2+對(duì)HDTMAB殺滅亞歷山大藻LC3的抑制效應(yīng)最顯著。通過對(duì)Ca2+抑制HDTMAB殺滅亞歷山大藻LC3機(jī)制的初步探討發(fā)現(xiàn),Ca2+及HDTMAB復(fù)合處理組與單純HDTMAB處理組相比,MDA含量降低,巰基含量升高,細(xì)胞質(zhì)膜透性減小。這表明,Ca2+對(duì)亞歷山大藻LC
11、3細(xì)胞抗HDTMAB脅迫的促進(jìn)作用主要是通過穩(wěn)定細(xì)胞膜、降低細(xì)胞膜透性實(shí)現(xiàn)的。 (6)對(duì)亞歷山大藻LC3細(xì)胞蛋白質(zhì)提取純化及其雙向電泳技術(shù)進(jìn)行研究。通過SDS-PAGE分析,發(fā)現(xiàn)其蛋白質(zhì)分子量主要集中于14~31kDa以及43~66kDa這兩個(gè)區(qū)域,其中尤以較低分子量的14~31kDa這一區(qū)間中的蛋白條帶最多。對(duì)雙向電泳蛋白樣品制備方法進(jìn)行優(yōu)化,藻蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜結(jié)果顯示,蛋白質(zhì)相對(duì)分子量約在14~100kDa范圍內(nèi),主要分布
12、在14~31kDa之間,這與SDS-PAGE結(jié)果一致;蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)分布在pH3.0~8.0的范圍內(nèi),主要分布在酸性端的3.0~6.0范圍內(nèi),采用pH3.0~5.6范圍的IPG預(yù)制膠條獲得了理想的分離效果,可分離出320個(gè)左右蛋白質(zhì)斑點(diǎn),結(jié)合pH3.0~10.0以及pH3.0~5.6的IPG預(yù)制膠條,可較好的分離亞歷山大藻LC3蛋白質(zhì)。 (7)利用SDS-PAGE對(duì)HDTMAB促進(jìn)谷氨酸銅殺滅亞歷山大藻LC3的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研
13、究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HDTMAB可造成藻蛋白表達(dá)量大幅降低,與對(duì)照組及單純谷氨酸銅處理組相比,蛋白條帶較少。利用SDS-PAGE及2-DE對(duì)谷氨酸銅殺滅亞歷山大藻LC3的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究,結(jié)果顯示,谷氨酸銅作用造成分子量大于31kDa的蛋白表達(dá)量大幅降低,但谷氨酸銅處理也誘導(dǎo)了一些低分子量蛋白質(zhì)的合成,這些低分子量蛋白可能是藻細(xì)胞在逆境脅迫下的一種自我保護(hù)。本節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,谷氨酸銅殺滅亞歷山大藻LC3及HDTMAB促進(jìn)殺滅的另一機(jī)制為:
14、造成藻細(xì)胞內(nèi)的部分蛋白質(zhì)變性和解體,進(jìn)而抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)。 (8)對(duì)3個(gè)谷氨酸銅脅迫下亞歷山大藻LC3雙向電泳圖譜上的差異蛋白點(diǎn),用基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜分析,并通過數(shù)據(jù)庫(kù)檢索進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定。分析比較數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果,篩選最合適匹配的記錄,發(fā)現(xiàn)1號(hào)蛋白與一種共生甲藻(Symbiodiniumsp.)的Ⅱ型1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)的前體(大亞基)匹配最好
15、;2號(hào)蛋白與單細(xì)胞綠色鞭毛植物(Mesostigmaviride)的RNA聚合酶β亞基匹配最好;3號(hào)蛋白則與一種紅藻(Guillardiatheta)的一種未知功能的蛋白最相似。1、2號(hào)蛋白均為在對(duì)照處理組中表達(dá)而在谷氨酸銅脅迫下受抑制的蛋白。造成谷氨酸銅脅迫下Rubisco(1號(hào)蛋白)表達(dá)缺失的原因主要有三方面:(1)谷氨酸銅脅迫造成的Rubisco的氧化修飾使Rubisco降解成無活性的小片段;(2)葉綠體結(jié)構(gòu)遭破壞,促進(jìn)了谷氨酸銅
16、對(duì)Rubisco合成的抑制;(3)Rubisco作為胞內(nèi)重要儲(chǔ)藏蛋白發(fā)生降解,這可能是細(xì)胞對(duì)脅迫的一種自主反應(yīng)。氧化修飾及葉綠體結(jié)構(gòu)遭破壞也是RNA聚合酶(2號(hào)蛋白)受抑制的原因。3號(hào)蛋白是亞歷山大藻LC3在谷氨酸銅脅迫下生成的新蛋白,這可能是藻細(xì)胞在逆境脅迫下的一種自我保護(hù)。 綜上所述,谷氨酸銅對(duì)亞歷山大藻LC3具有較強(qiáng)的滅除作用,其殺滅赤潮藻效率優(yōu)于硫酸銅。HDTMAB可有效促進(jìn)谷氨酸銅殺滅有害赤潮藻,且促進(jìn)作用基本隨著HD
17、TMAB濃度的提高而同步增強(qiáng)。對(duì)谷氨酸銅及HDTMAB等脅迫下,亞歷山大藻LC3在細(xì)胞生理活性(膜透性、MDA及巰基含量)、形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)等方面均發(fā)生了顯著變化,這些變化說明,谷氨酸銅和HDTMAB通過破壞細(xì)胞膜來抑制藻的生長(zhǎng)。利用2-DE及質(zhì)譜技術(shù)對(duì)脅迫條件下的蛋白變化進(jìn)行的研究表明,谷氨酸銅可造成藻細(xì)胞內(nèi)的部分蛋白質(zhì)變性和解體,進(jìn)而抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)。谷氨酸銅殺藻的機(jī)制可以歸結(jié)為兩點(diǎn):(1)使藻質(zhì)膜受到損傷;(2)造成藻細(xì)胞內(nèi)的部分蛋白
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