腎安Ⅱ號對體外培養(yǎng)大鼠GMC增殖及TNFa、NF-KB表達的影響.pdf

1、目的：通過對大鼠腎小球系膜細胞的體外培養(yǎng)，觀察腎安Ⅱ號對大鼠腎小球系膜細胞增殖及NF-KB和TNF-a表達的影響，進而探討其阻緩腎纖維化的可能作用機制。 方法：1.直接購買大鼠GMC細胞株，應用體外細胞培養(yǎng)技術，進行大鼠腎小球系膜細胞培養(yǎng)，并選擇脂多糖為刺激物。 2.在體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞中，按不同分組：①GMC組(普通培養(yǎng)液)；②LPS組(含LPS的培養(yǎng)液)；③腎安組(含不同濃度腎安Ⅱ號的培養(yǎng)液)，分別加入不同

2、培養(yǎng)液，于培養(yǎng)24小時和48小時后在顯微鏡下進行細胞生長的形態(tài)學觀察。 3.用臺盼藍染色計數(shù)法測含不同濃度腎安Ⅱ號培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下的大鼠腎小球系膜細胞的細胞活力，觀察腎安Ⅱ號對大鼠腎小球系膜細胞的毒性作用，從而確定實驗用含腎安Ⅱ號培養(yǎng)液的合理濃度。 4.在體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞中，按不同分組加入不同培養(yǎng)液：①GMC組；②LPS組；③腎安低劑量組；④腎安中劑量組；⑤腎安高劑量組，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法，于24

3、小時、和48小時觀察各組標本中大鼠腎小球系膜細胞增殖水平，進而選擇藥物作用的最佳濃度及時間段。 5.在體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞中，按不同分組加入不同培養(yǎng)液：①GMC組；②LPS組；⑨腎安組，采用免疫細胞化學技術法觀察各組標本中大鼠腎小球系膜細胞表達NF-KB和TNF-a的情況。 結果：1.大鼠腎小球系膜細胞的體外培養(yǎng)結果經(jīng)傳代培養(yǎng)后的大鼠腎小球系膜細胞，一般24小時全部貼壁，純度極高，生長迅速，很快融合成片，密集時可

4、重疊生長，2-3天即可進行傳代培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)成功且符合實驗要求。 2.大鼠腎小球系膜細胞形態(tài)學觀察結果在倒置顯微鏡下觀察，可見正常組大鼠腎小球系膜細胞體積較大，且純度極高，形態(tài)多為梭形或星形。經(jīng)HE染色后，位相顯微鏡下見細胞結構十分清晰，胞漿內(nèi)可見大量微絲樣結構，核居中央，多呈圓形或橢圓形，核周胞質散布大量的細胞小顆粒。與相關文獻報道一致。經(jīng)LPS處理24小時后，光鏡下可見LPS組大鼠腎小球系膜細胞增生明顯，細胞體積增大，但附壁

5、能力弱，易脫落，相鄰細胞間連接性有所降低。48小時后大鼠腎小球系膜細胞體積有所縮小，形態(tài)變圓，核固縮開始出現(xiàn)，核顏色加深，折光性增強。而經(jīng)中藥腎安Ⅱ號處理的腎安組大鼠腎小球系膜細胞貼壁生長良好，幾乎無脫落，胞漿飽滿，相鄰細胞生長融合成片。形態(tài)學觀察與正常組一致。 3.大鼠腎小球系膜細胞毒性試驗結果經(jīng)臺盼藍染色排斥試驗顯示：腎安Ⅱ號25％，12.5％和6.25％濃度組24小時，48小時和72小時細胞活力均達90％以上。經(jīng)X2檢驗，

6、腎安Ⅱ號上述三組細胞活力與空白組比較，無顯著性差異(P＞0.05)。 4.大鼠腎小球系膜細胞增殖測定結果MTT法測OD值顯示：(1)腎安Ⅱ號24小時和48小時對大鼠腎小球系膜細胞的抑制作用與濃度呈顯著的正相關關系(r=0.979和0.991，P＜0.05)；(2)LPS組大鼠腎小球系膜細胞增生水平明顯高于GMC組(P＜0.01)；(3)腎安Ⅱ號各濃度組大鼠腎小球系膜細胞增生水平明顯低于LPS組(P＜0.01)。 5.大鼠

7、腎小球系膜細胞中NF-KB、TNF-a表達結果免疫細胞化學染色(48h組)顯示：(1)三組標本中均有不同程度的NF-KB和TNF-a的陽性表達；(2)LPS組NF-KB、TNF-a表達明顯高于GMC組(P＜0.01)；(3)腎安組NF-KB、TNF-a表達與GMC組無顯著性差異(P＞0.05)；(4)腎安組NF-KB、TNF-a表達明顯低于LPS組(P＜0.01)。 結論：本研究表明：1.腎安H號對體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞無