魚藤酮對(duì)大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的影響及其與鐵的聯(lián)合作用.pdf

1、魚藤酮(rotenone)曾被認(rèn)為是一種安全可靠的農(nóng)藥而被廣泛應(yīng)用。但是近年來的研究發(fā)現(xiàn),魚藤酮慢性外周暴露能誘發(fā)大鼠出現(xiàn)類帕金森癥(Parkinson's disease,PD)的行為學(xué)特征和病理學(xué)改變。魚藤酮直接作用于中腦黑質(zhì)致密部(substantia nigra compact,SNc)是否能引起動(dòng)物PD運(yùn)動(dòng)障礙和相應(yīng)的細(xì)胞毒性效應(yīng)?魚藤酮毒性作用引起SNc神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)哪些生理生化改變,從而誘導(dǎo)DA能神經(jīng)元進(jìn)行性損傷?這些對(duì)

2、于闡明魚藤酮引起PD癥狀的神經(jīng)機(jī)制具有重要作用。然而有關(guān)的實(shí)驗(yàn)證據(jù),特別是黑質(zhì)直接暴露后細(xì)胞內(nèi)生理生化研究還相對(duì)缺乏。此外,臨床分析表明,PD患者SNc鐵元素水平顯著升高,提示鐵元素與PD的發(fā)病有著密切的聯(lián)系。而對(duì)SNc區(qū)鐵水平的升高是否能協(xié)同神經(jīng)毒素魚藤酮而加速DA能神經(jīng)元的損傷,還未曾有研究報(bào)道涉及。本工作采用向大鼠中腦SNc直接微注射魚藤酮和鐵離子,結(jié)合行為學(xué)、免疫組織化學(xué)及熒光標(biāo)記、生物化學(xué)等方法,探討魚藤酮對(duì)SNc多巴胺能神經(jīng)

3、元的損傷機(jī)制及其與鐵離子的聯(lián)合作用。 主要結(jié)果如下： 1.魚藤酮及其與鐵聯(lián)合暴露后,大鼠在垂直網(wǎng)格上的移動(dòng)延時(shí)與對(duì)照組和同組暴露前相比均有顯著延長(zhǎng)。在斜板實(shí)驗(yàn)中,暴露組大鼠從斜板上滑落的次數(shù)顯著多于對(duì)照組和同組暴露前,聯(lián)合暴露組大鼠滑落次數(shù)較同濃度魚藤酮單獨(dú)暴露組有所增加。開闊實(shí)驗(yàn)中,魚藤酮及其與鐵聯(lián)合暴露后大鼠的探洞次數(shù)、直立時(shí)間較對(duì)照組和同組暴露前均顯著減少,靜止型靜坐時(shí)間顯著增加,且表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。

4、2.魚藤酮暴露組大鼠黑質(zhì)致密部酪氨酸羥化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)免疫陽(yáng)性神經(jīng)元密度較對(duì)照組顯著降低。殘存的TH陽(yáng)性神經(jīng)元呈現(xiàn)細(xì)胞萎縮、神經(jīng)突起減少或消失等進(jìn)行性退變特征。與對(duì)照組和同濃度魚藤酮單獨(dú)暴露組相比,魚藤酮與鐵聯(lián)合暴露組大鼠SNc區(qū)TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞密度均顯著減少。運(yùn)用Hoechst33342熒光染色方法來特異性標(biāo)記SNc損失神經(jīng)元中的細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示魚藤酮及其與鐵聯(lián)合暴露后黑質(zhì)凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著增

5、加,且鐵和魚藤酮聯(lián)合暴露引起的細(xì)胞凋亡數(shù)較魚藤酮單獨(dú)暴露要多。 3.與對(duì)照組比較,魚藤酮暴露組大鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)△Ψm降低,反映魚藤酮作用引發(fā)細(xì)胞線粒體功能障礙。魚藤酮暴露后乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活力升高,反映毒性作用引起細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)不足。同時(shí)檢測(cè)出魚藤酮暴露后SN神經(jīng)元活性氧自由基(reactive oxy

6、gen species,ROS)水平明顯升高,而清除自由基的谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)活力顯著降低。與魚藤酮單獨(dú)暴露組比較,鐵和魚藤酮聯(lián)合暴露組SN神經(jīng)元ROS水平明顯升高、GSH-PX活力則顯著降低。以上結(jié)果表明： 1.魚藤酮直接作用于SNc區(qū)能誘發(fā)大鼠出現(xiàn)靜止性震顫、肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)徐緩等類PD運(yùn)動(dòng)行為障礙,適量鐵的暴露則能加強(qiáng)魚藤酮誘發(fā)類PD癥狀的效應(yīng)。 2.魚藤

7、酮及其與鐵聯(lián)合暴露能引起動(dòng)物黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元出現(xiàn)進(jìn)行性退變的病理學(xué)特征,并出現(xiàn)明顯的缺失。魚藤酮神經(jīng)毒性作用引起黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡的特征明顯；鐵的聯(lián)合暴露能加劇黑質(zhì)神經(jīng)元的缺失及細(xì)胞凋亡。 3.△Ψm降低導(dǎo)致的線粒體功能障礙是魚藤酮誘發(fā)在體黑質(zhì)神經(jīng)元損傷的引發(fā)因素。細(xì)胞內(nèi)ROS的累積和能量代謝障礙可能是誘發(fā)黑質(zhì)DA能神經(jīng)細(xì)胞凋亡的主要原因； 4.鐵離子主要通過影響DA能神經(jīng)元的細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng),協(xié)同魚藤酮增強(qiáng)神經(jīng)毒性

8、效應(yīng)。 本論文工作觀察了在體黑質(zhì)神經(jīng)元直接暴露魚藤酮對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng),從整體動(dòng)物、細(xì)胞水平及細(xì)胞內(nèi)生理角度探討了魚藤酮誘發(fā)PD的神經(jīng)毒性機(jī)理。研究結(jié)果表明魚藤酮作用于神經(jīng)細(xì)胞,造成線粒體膜電位△Ψm的降低,可能是引發(fā)黑質(zhì)神經(jīng)元損傷的重要因素,而細(xì)胞內(nèi)ROS的累積和能量代謝障礙相互作用可能是誘發(fā)黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要原因。實(shí)驗(yàn)首次觀察到Fe對(duì)魚藤酮神經(jīng)毒作用的協(xié)同效應(yīng)。鐵離子主要通過影響細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)的功能而發(fā)揮