一次性電化學(xué)酒精生物傳感器的研究.pdf

1、近年來(lái)，隨著交通運(yùn)輸業(yè)的迅速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，機(jī)動(dòng)車和擁有駕駛執(zhí)照的人員數(shù)量快速增長(zhǎng)，交通事故頻繁發(fā)生，其中因駕駛?cè)藛T飲酒與醉酒造成的交通事故就占20％。 長(zhǎng)期以來(lái)，由于我國(guó)一直沒(méi)有檢測(cè)酒后（飲酒8小時(shí)之內(nèi)）駕車的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，又沒(méi)有一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)血酒精濃度的便攜式檢測(cè)儀。因此當(dāng)酒后駕車人員面臨交通警察處罰時(shí)，還“理直氣壯”地要法律條例，處罰證據(jù)。 目前血酒精濃度（blood alcohol conce

2、ntration，BAC）測(cè)定的主要方法有：呼氣法、分光光度法、氣相色譜法。呼氣法雖然操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，但只能定性，不能準(zhǔn)確定量檢測(cè)。分光光度法和氣相色譜法均需要血漿或血清樣本，受試者要到醫(yī)院或?qū)I(yè)機(jī)構(gòu)抽取靜脈血，給受試者及交管部門(mén)帶來(lái)極大不便。綜上所述，呼氣法、分光光度法、氣相色譜法不能滿足簡(jiǎn)便、快速定量檢測(cè)血酒精濃度的要求。 生物傳感器是分析生物技術(shù)的一個(gè)重要領(lǐng)域，它是一個(gè)典型的多學(xué)科交叉產(chǎn)物，結(jié)合了生命科學(xué)、分析化學(xué)、物

3、理學(xué)和信息科學(xué)及其相關(guān)技術(shù)，能夠?qū)λ枰獧z測(cè)的物質(zhì)進(jìn)行快速分析和追蹤。經(jīng)過(guò)30多年的發(fā)展，已經(jīng)成為一個(gè)涉及內(nèi)容廣泛、多學(xué)科介入和交叉、充滿創(chuàng)新活力的領(lǐng)域。生物傳感器由于其高選擇性、高靈敏度，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于臨床診斷、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。 以酶作為分子識(shí)別器件的電化學(xué)生物傳感器稱為酶電極。酶電極是由一個(gè)固定化的酶敏感膜和與之密切結(jié)合的電極組成的換能系統(tǒng)，它把固化酶和電極結(jié)合在一起。要使酶作為電化學(xué)生物傳感器的敏感膜使用，必

4、須將酶固定在電極表面，即在電極表面覆蓋一層敏感膜。在固定過(guò)程中，既要保持酶本身固有的特性，又要避免自由酶應(yīng)用上的缺陷。因此酶的固定化技術(shù)決定著酶電極的穩(wěn)定性、選擇性和靈敏度等主要性能。 絲網(wǎng)印刷是印刷業(yè)的一項(xiàng)傳統(tǒng)工藝，有悠久的歷史。20世紀(jì)60年代以后廣泛用于電子工業(yè)生產(chǎn)，作為制作電路板的主要工序。1981年，一項(xiàng)專利文獻(xiàn)報(bào)道將絲網(wǎng)印刷技術(shù)用于厚膜電化學(xué)傳感器的制作。絲網(wǎng)印刷技術(shù)主要優(yōu)點(diǎn)包括：①可以在表面印制各種圖案，設(shè)計(jì)十分靈

5、活；②印刷過(guò)程容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；③重現(xiàn)性好；④適用于各種材質(zhì)；⑤成本低廉，因此能夠大批量生產(chǎn)重現(xiàn)性好的生物傳感器。由于傳感器成本很低，可以一次性使用，即所謂“用過(guò)即扔”，對(duì)臨床檢驗(yàn)非常方便。 本研究將電化學(xué)酶?jìng)鞲衅?、納米技術(shù)、絲網(wǎng)印刷技術(shù)、臨床檢驗(yàn)分析技術(shù)結(jié)合起來(lái)制備一次性酒精生物傳感器，探討了pH、緩沖液、溫度、干擾物等對(duì)傳感器響應(yīng)電流的影響，并用于實(shí)際樣品酒精濃度檢測(cè)，表現(xiàn)出了良好的特異性、敏感性、重復(fù)性、穩(wěn)定性，而且響應(yīng)時(shí)間

6、快、線性范圍寬，為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室和交通執(zhí)法部門(mén)提供了一種快速檢測(cè)血酒精濃度的參考。 本研究主要分為以下兩個(gè)部分： 1.基于交聯(lián)法固定酶的絲網(wǎng)印刷電極（screen-printed electrode，SPE）酒精生物傳感器的制備。方法：1）絲網(wǎng)印刷電極的制備：在0.2mm厚的聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）薄膜上首先印刷一層導(dǎo)電銀膜，再用碳漿印刷直徑為3mm的圓盤(pán)作為工作電極，然后用PVC油墨印刷在導(dǎo)

7、電銀膜上作為絕緣層。2）Nafion-MB修飾電極的制備：絲網(wǎng)印刷電極在室溫下依次用乙醇和超純水超聲清洗10min，然后在空氣中晾干。將5％（w/w）Nafion-117溶液用無(wú)水乙醇稀釋到1％（W/W），然后吸取5μL1％的Nafion-乙醇溶液滴加在絲網(wǎng)印刷電極的工作區(qū)域，在空氣中干燥，待電極表面干燥后形成一層Nafion膜。然后將Nafion修飾的絲網(wǎng)印刷電極置于含1mmol/L麥爾多拉藍(lán)（Meldola's blue，MB）的磷

8、酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（0.1mol/L，pH8.0）中用循環(huán)伏安法以50mV/s的掃描速度進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，使MB通過(guò)離子交換固定到Nafion膜中。3）酒精生物傳感器的制備：把4mg乙醇脫氫酶（Alcohol Dehydrogenase，ADH）、5mg NAD+（Nicotinamide Adenine Dinucleotide）、10mg牛血清白蛋白（bovine serum a

9、lbumin，BSA）溶于200μL磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH8.0）中，再加入20μL2.5％戊二醛溶液充分混合；再吸取5μL此溶液滴加到已制備好的Nafion-MB修飾絲網(wǎng)印刷碳電極（screen-printed carbon electrode，SPCE）工作區(qū)域，在空氣中干燥，溶劑蒸發(fā)后形成一層酶膜，制成酒精生物傳感器。制成的酒精生物傳感器在使用前被置于4℃冰箱保存。結(jié)果：所有測(cè)試均在電化學(xué)工作站中三電極系統(tǒng)下完成，飽

10、和甘汞電極（saturated calomelelectrode，SCE）作為參比電極，鉑絲作為對(duì)電極，Nafion-MB-酶修飾絲網(wǎng)印刷電極作為工作電極。該傳感器在25℃時(shí)，以-0.17V（vs.SCE）作為工作電位，在pH為8.0的磷酸鹽緩沖液中響應(yīng)電流達(dá)到最大。傳感器檢出限為1.1×10-5mol/L，達(dá)到95％穩(wěn)態(tài)響應(yīng)時(shí)間不超過(guò)30S。用同一支生物傳感器對(duì)含1mmol/L的酒精的磷酸鹽緩沖液（pH8.0）重復(fù)測(cè)定10次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)

11、偏差（relative standard deviation，RSD）為3.6％。在5個(gè)批次印制的絲網(wǎng)印刷電極中隨機(jī)抽樣5個(gè)電極制成酒精生物傳感器，分別對(duì)含1mmol/L的酒精的磷酸鹽緩沖液（pH8.0）重復(fù)測(cè)定3次取其平均值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3％。酒精生物傳感器于4℃冰箱放置10、20、30天后，對(duì)相同濃度的底物響應(yīng)電流分別減少了3.7％、5.2％、8.4％。甲醇、糖、乳酸、抗壞血酸等均不會(huì)影響生物傳感器對(duì)酒精的響應(yīng)。結(jié)論：該酒精生

12、物傳感器可以快速檢測(cè)酒精濃度，表現(xiàn)出良好的特異性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和抗干擾能力，可以為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)酒精濃度提供一個(gè)參考。 2.基于Nafion和納米金（gold nanoparticles，GNPs）固定酶的絲網(wǎng)印刷電極酒精生物傳感器的制備。方法：1）納米金的制備：取一定量的氯金酸溶液加熱至沸，迅速加入檸檬酸鈉溶液還原。所制備的溶液置于棕色瓶?jī)?nèi)于4℃保存。納米金溶膠的顏色為亮紅色，其粒徑可用透射電子顯微鏡測(cè)試約為20nm。2

13、）MB修飾的絲網(wǎng)印刷電極的制備：用聚酯作為生物傳感器的基質(zhì)材料，在聚酯上首先印刷一層導(dǎo)電銀膜，再用混合2％（w/w）MB的碳漿印刷直徑為3mm的圓盤(pán)作為工作電極，然后印刷UV膠作為絕緣層。銀漿和碳漿印刷后，電極在40℃干燥2h以除去所應(yīng)用油墨中的水分。UV膠印刷后需進(jìn)行UV固化。3）酒精生物傳感器的制備：MB修飾的絲網(wǎng)印刷電極在室溫下依次用無(wú)水乙醇和超純水超聲清洗10min，然后在空氣中晾干。把4mg ADH、5mg NAD+溶于200

14、μL磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH8.0）中配成酶液。再把100μL酶液和100μL5％（w/w）Nafion溶液充分混合。然后100μL納米金溶液被加入以上溶液并充分混合。接著10μL混合溶液被滴加到MB修飾絲網(wǎng)印刷電極的工作區(qū)域，在空氣中干燥，溶劑蒸發(fā)后形成一層酶膜，制成酒精生物傳感器。制成的酒精生物傳感器在使用前被置于4℃冰箱保存。結(jié)果：所有測(cè)試均在電化學(xué)工作站中三電極系統(tǒng)下完成，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑絲作為對(duì)電極，M

15、B-酶-Nafion-GNPs修飾絲網(wǎng)印刷電極作為工作電極。該傳感器在25℃時(shí)，以0.0V（vs.SCE）作為工作電位，在pH為8.0的磷酸鹽緩沖液中響應(yīng)電流達(dá)到最大。傳感器檢出限為1.6×10-5mo/L，檢測(cè)上限達(dá)到了8mmol/L，達(dá)到95％穩(wěn)態(tài)響應(yīng)時(shí)間不超過(guò)40S。用同一個(gè)生物傳感器在1天內(nèi)對(duì)兩個(gè)不同的酒精濃度（1和5mmol/L）分別連續(xù)檢測(cè)10次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.49和1.44％。從10批絲網(wǎng)印刷電極中隨機(jī)抽取10支電極制

16、成酒精生物傳感器，然后用這10支不同的生物傳感器分別對(duì)兩個(gè)不同的酒精濃度（1和5mmol/L）進(jìn)行檢測(cè)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.98和2.49％。酒精生物傳感器于4℃冰箱放置10、20、30天后，對(duì)1mmol/L酒精響應(yīng)電流分別減少了3.1％、4.6％、7.7％。甲醇、糖、乳酸、抗壞血酸等均不會(huì)影響生物傳感器對(duì)酒精的響應(yīng)。結(jié)論：該酒精生物傳感器可以快速檢測(cè)血酒精濃度，表現(xiàn)出良好的特異性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和抗干擾能力，可以為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)血酒