通過裂腹魚類的轉(zhuǎn)錄組比較分析揭示青藏高原魚類的適應(yīng)性進(jìn)化.pdf

1、裂腹魚隸屬于鯉形目鯉科魚類，廣泛分布于青藏高原。它們對青藏高原高海拔，低溫，低氧，強(qiáng)紫外線輻射等極端環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性。因此逐漸成為了一種理想的適應(yīng)性進(jìn)化研究模型。雖然近年來已有學(xué)者將裂腹魚類和親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的平原魚類做了比較分析，在一定程度上揭示了裂腹魚類的遺傳適應(yīng)性。但是有關(guān)青藏高原上親緣關(guān)系較近的裂腹魚類之間的比較研究目前還比較缺乏。在本文中通過兩項(xiàng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的比較研究，憑借高通量測序的大數(shù)據(jù)優(yōu)勢，分別對高、中、低三個(gè)海拔鯉科魚類的

2、轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析，闡述了裂腹魚類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及其高原適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制。
　　首先，選擇分布于不同海拔的2種裂腹魚類：生活在較高海拔（海拔約4000米）的特化等級類群裂腹魚——軟刺裸鯉（Gymnocypris dobula）、生活在較低海拔（海拔約1200米）的原始等級類群裂腹魚——怒江裂腹魚（Schizothorax nukiangensis），同時(shí)以生活在平原的鯉科魚類——斑馬魚（Danio rerio）作為對照比較分析。應(yīng)用

3、 Illumina測序，獲得2種裂腹魚類共8個(gè)組織的測序原始reads，去除接頭以及低質(zhì)量的reads后，利用Trinity從頭組裝，得到2個(gè)物種的contigs序列，基于Transdecoder預(yù)測2個(gè)轉(zhuǎn)錄組的編碼基因，再對預(yù)測的編碼基因分別進(jìn)行NR、KOG、GO和KEGG等多種數(shù)據(jù)庫注釋。最后采用同源基因查找軟件 OrthoMCL篩選得到了三個(gè)物種的同源基因聚類。經(jīng)過同源基因的序列比對以及過濾處理后，共計(jì)得到11007個(gè)單拷貝直系同

4、源基因用于后續(xù)進(jìn)化分析。利用 PAML中的自由率模型計(jì)算單拷貝直系同源基因的dN/dS值，比較發(fā)現(xiàn)裂腹魚類的進(jìn)化速率明顯較斑馬魚快，并且許多GO通路的進(jìn)化速率也顯著加快。說明由于青藏高原的隆起，裂腹魚類的生存環(huán)境發(fā)生了改變，為了適應(yīng)環(huán)境，經(jīng)歷了一個(gè)快速進(jìn)化的過程。隨后對兩種海拔的裂腹魚分別使用PAML的分支-位點(diǎn)模型鑒定正選擇基因。它們主要分布在低氧應(yīng)答、能量代謝和心血管系統(tǒng)發(fā)育等與高原適應(yīng)性相關(guān)的生物學(xué)過程。進(jìn)一步的GO富集表明在兩種

5、裂腹魚中正選擇基因富集在不同的GO條目，提示兩種裂腹魚的對高原的適應(yīng)機(jī)制可能是不同的。
　　其次，選擇了分布在高低兩個(gè)海拔的4種裂腹魚：兩種高海拔裂腹魚——軟刺裸鯉（Gymnocypris dobula）、裸腹葉須魚（Ptychobarbus kaznakovi）和兩種亞高海拔裂腹魚——貢山裂腹魚（ Schizothorax gongshanensi）、青海湖裸鯉（Gymnocypris przewalskii przewalsk

6、ii），同時(shí)選擇兩種平原鯉科魚類——斑馬魚（ Danio rerio）和草魚（Ctenopharyngodon idellus）比較分析轉(zhuǎn)錄組。對4種裂腹魚的5個(gè)組織提取RNA轉(zhuǎn)錄組測序。按照前文類似的方法，得到了6個(gè)物種共計(jì)7532個(gè)單拷貝直系同源基因家族，提取這些基因的4倍簡并位點(diǎn)串聯(lián)后，Modeltest檢測最優(yōu)模型為GTR+G+I，Paup基于最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示高海拔裂腹魚、亞高海拔裂腹魚以及平原鯉科魚類分別各自

7、聚為一個(gè)類群，而裂腹魚亞科魚類又聚為一個(gè)大類，并且進(jìn)化樹支持率（自展值為100）較高。參考多個(gè)已有文獻(xiàn)報(bào)道的鯉科魚類分歧時(shí)間，運(yùn)用PAML包中的MCMCtree估算了裂腹魚亞科魚類的分歧年代，結(jié)果表明，裂腹魚亞科魚類的共同祖先在3270萬年前分化，與青藏高原第一個(gè)階段隆起的時(shí)間一致。高海拔裂腹魚分化的年代大約在810萬年前，正好是青藏高原第二個(gè)抬升階段開始的時(shí)間這都表明青藏高原的隆起和裂腹魚類的分化具有一致性。此外與平原鯉科魚類相比，所

8、有裂腹魚類的dN/dS值都顯著升高，并且一些和高原適應(yīng)相關(guān)的能量代謝、低氧應(yīng)答以及DNA修復(fù)等方面的GO條目的進(jìn)化速率也明顯加快，說明青藏高原的魚類經(jīng)歷了一個(gè)快速的進(jìn)化過程。通過分支-位點(diǎn)模型計(jì)算和似然比檢驗(yàn)，在高海拔裂腹魚和亞高海拔裂腹魚中分別鑒定得到了208個(gè)和137個(gè)正選擇基因，其中僅有12個(gè)基因是重合的。分別對這些正選擇基因進(jìn)行 GO富集，GO功能也呈現(xiàn)了不同的富集分布，在包括“感官器官形態(tài)發(fā)生”、“蛋白質(zhì)泛素化調(diào)節(jié)”、“血液循

9、環(huán)”和“血管發(fā)育”等方面都出現(xiàn)了差異。這些結(jié)果提示在高海拔和亞高海拔的裂腹魚亞科魚類在青藏高原隆起的過程中可能面對不同的選擇壓力。比較正選擇基因和已知的低氧應(yīng)答相關(guān)基因，在兩個(gè)海拔的裂腹魚中分別得到了28個(gè)和21個(gè)低氧應(yīng)答相關(guān)的正選擇基因，其中部分基因還參與能量代謝過程，說明裂腹魚類的能量代謝網(wǎng)絡(luò)和低氧應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)可能是相互聯(lián)系的。
　　最后基于 FPKM法計(jì)算了兩個(gè)海拔裂腹魚的基因表達(dá)譜，然后利用DEGseq比較基因的表達(dá)差異，顯示