幾種不同魚類肥胖基因的克隆與鯉肥胖基因的表達研究.pdf

1、自從人和小鼠的肥胖基因克隆后，肥胖基因一直成為國內(nèi)外研究的熱點。肥胖基因編碼的蛋白質(zhì)(leptin)是反映體內(nèi)脂肪含量的重要信號因子，leptin主要作用于下丘腦的特異受體，通過下丘腦進行攝食調(diào)控和維持能量代謝的平衡，leptin還對機體的免疫應(yīng)答，繁殖功能，神經(jīng)內(nèi)分泌等功能具有重要的作用，具有廣泛的生物學效應(yīng)?，F(xiàn)在已經(jīng)克隆出了人、鼠、豬等動物的肥胖基因，并對其生物功能和表達特點進行了深入的研究。而有關(guān)魚類的ob基因及其功能的研究很少見

2、相關(guān)報道。魚類品種繁多，不同品種的魚類具有不同的攝食習性，并且魚類體內(nèi)脂肪的含量、攝食量以及飽食感與其攝食習性均有較大程度的差異，而對魚類ob基因的研究將有利于闡明不同品種魚類的攝食習性與機體的脂肪含量、攝食量以及飽食感之間的關(guān)系，對研究魚類攝食調(diào)控的分子機理具有重要意義。本研究試圖克隆不同攝食習性魚類的ob基因，研究該基因在魚體內(nèi)和體外的表達特點，為研究魚類ob基因的功能奠定基礎(chǔ)。主要研究工作和結(jié)果如下：1.幾種不同魚類肥胖基因的克隆

3、提取不同攝食習性魚類腸系膜脂肪組織的RNA，包括雜食性魚類：鯉、鯽；草食性魚類：草魚、團頭魴；濾食性魚類：鳙、鰱；肉食性魚類：青魚、烏鱧、大口鲇、鰻鱺、史氏鱘。利用RT-PCR技術(shù)從鯉腸系膜脂肪組織中擴增出鯉肥胖基因的cDNA編碼序列，將其克隆至pMD18-T載體進行序列測定。測序結(jié)果表明，幾種不同攝食習性魚類的ob基因編碼區(qū)均由438個核苷酸組成，編碼146個氨基酸，幾種不同魚類ob基因之間僅有2-4個核苷酸發(fā)生變異，導致1-2個氨基

4、酸發(fā)生改變。魚類ob基因的核苷酸和氨基酸的同源性均達到99％，與Genebank中ob基因序列的同源性進行比較，ob基因具有很強的保守性，鯉ob基因與人、豬、小鼠核苷酸同源性分別為：84％、86％、95％，氨基酸的同源性分別為84％、82％、96％。 2.鯉不同組織和不同胚胎發(fā)育階段ob基因的表達提取鯉不同組織(心臟、脾臟、肝臟、腎臟、肌肉、腦、脂肪)和不同發(fā)育階段胚胎(卵巢、桑椹期、囊胚、原腸胚、神經(jīng)胚、肌肉效應(yīng)期、心跳期、出

5、苗前期、出苗期)的RNA，利用RT-PCR方法對其進行檢測,結(jié)果表明，鯉ob基因在鯉不同組織中均有表達，在肝臟和脂肪組織中的表達量較高，在其他組織中也有一定的表達；鯉ob基因在未受精卵和不同的胚胎發(fā)育階段均有有表達。由于未進行定量RT-PCR，本研究尚不能確定鯉ob基因在不同的胚胎發(fā)育中是否具有發(fā)育性變化。人和小鼠的ob基因主要在脂肪組織中表達，在胚胎中也有表達，本研究表明鯉ob基因的表達與人和小鼠相比具有較大的差異。 3.鯉o

6、b基因的表達節(jié)律及不同生理條件對ob基因表達的影響本研究由兩部分組成。試驗Ⅰ：鯉ob基因在不同生理條件下的表達，將40尾鯉按體重隨機分成4組，每組10尾，分別設(shè)置為正常對照組、饑餓組，飽食組和高脂肪組，14d后采集血清，分別測量血糖、膽固醇、甘油三酯、胰島素和leptin的濃度。結(jié)果表明，高脂肪組血糖濃度高于正常組(P＜0.05)、饑餓組(P＜0.01)和飽食組，饑餓組與正常組和飽食組具有明顯的差異(P＜0.01)；膽固醇在不同的試驗組

7、中卻沒有明顯的差異；高脂肪組中甘油三酯的濃度高于其他組別，與正常組(P＜0.01)和饑餓組(P＜0.01)相比具有顯著差異，與飽食組差異不顯著，饑餓組甘油三酯的濃度明顯低于正常組和飽食組，并且差異極顯著(P＜0.01)；高脂肪組中胰島素的濃度均高于其他組別，并且差異極顯著(P＜0.01)，饑餓組胰島素濃度低于正常組，差異極顯著(P＜0.01)，飽食組與正常組之間沒有差異；高脂肪組中l(wèi)eptin濃度均高于其他組別，與正常組和饑餓組比較差異

8、極顯著(P＜0.01)，與飽食組差異顯著(P＜0.05)，饑餓組leptin濃度低于正常組和飽食組，差異極顯著(P＜0.01)，血清leptin濃度與鯉體重(rs=0.817，P＜0.01)、血糖濃度(rs=0.608，P＜0.01)、甘油三酯濃度(rs=0.521，P＜0.01)、胰島素濃度(rs=0.831，P＜0.01)濃度正相關(guān)。 試驗Ⅱ：鯉ob基因的晝夜分泌表達規(guī)律，將192尾鯉分成2組，分別喂以基礎(chǔ)飼料和高脂肪飼料，

9、45天后采集血清，從上午10:00開始，24h之內(nèi)每隔2小時采集一次，每次8尾，分別測量不同時間鯉ob基因的leptin濃度。結(jié)果顯示，高脂肪組中鯉血清leptin的濃度明顯高于正常組中鯉血清leptin的濃度(P＜0.01)。兩組的晝夜節(jié)律的低谷均出現(xiàn)在中午12:00左右，高峰出現(xiàn)在午夜至4：00左右，正常組和肥胖組晝夜變化幅度分別為73.5％和33.1％。表明正常組和高脂肪組鯉ob基因均出現(xiàn)一定的晝夜分泌表達規(guī)律。 4.鯉o

10、b基因在大腸桿菌中的融合表達及生物學活性分析將鯉ob基因克隆至融合性原核表達載體pET-28a中，構(gòu)建了鯉ob基因表達載體pET-28a-ob，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21進行誘導表達，對表達產(chǎn)物進行提取和純化，SDS-PAGE檢測表明，鯉ob基因在大腸桿菌中實現(xiàn)了融合表達，經(jīng)凝膠掃描分析，目的蛋白占總蛋白的40％以上。產(chǎn)物的分子量約為20KD，Westernblot分析表明，融合蛋白具有較好的免疫學活性。建立了小鼠肥胖模型。將40只昆明小鼠隨

11、機分成兩組，分別喂以基礎(chǔ)飼料和高脂飼料，45天后分為4組，設(shè)為正常對照組、正常注射組、肥胖對照組和肥胖注射組，每組10只，正常注射組和肥胖注射組注射10ug/kg的重組蛋白，對照組注射10ug/kgPBS。記錄攝食量和體重變化，7d后采集血清，測量血清中血糖、膽固醇、胰島素和甘油三酯的濃度。結(jié)果表明，重組鯉leptin能夠降低正常小鼠和肥胖小鼠的攝食量和體重和體脂量，能夠降低肥胖小鼠的血糖、膽固醇、胰島素和甘油三酯的濃度，能夠減少肥胖小

12、鼠的leptin抵抗現(xiàn)象，并且小鼠體脂的含量與血糖(rs=0.46，P＜0.05)、膽固醇(rs=0.78，P＜0.01)、甘油三酯(rs=0.767，P＜0.01)、胰島素(rs=0.62，P＜0.01)具有明顯的正相關(guān)性。 5.鯉ob基因在畢赤酵母中的表達將鯉ob基因克隆至含有AOXl啟動子和a-factor信號序列的酵母表達載體pPIC9K中，構(gòu)建了重組表達載體pPIC9K-ob，經(jīng)過PCR和酶切鑒定正確后，用SalⅠ線性