EphA2及E-cadherin基因表達與食管癌發(fā)生及浸潤轉移的關系的研究.pdf

1、背景和目的；樹突狀細胞(dendriticcell，DC)是一類專業(yè)的抗原遞呈細胞，在體內(nèi)具有強大的激發(fā)初次免疫和再次免疫的能力。已有研究發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞除了通過細胞間直接接觸和分泌細胞因子參與機體免疫調(diào)節(jié)的作用方式之外，還可通過分泌具有抗原遞呈能力的囊泡狀小體exosomes來誘導T細胞免疫反應。Exosome是直徑為30nm-100nm的囊泡狀小體，許多細胞都具有分泌exosome的能力，例如肥大細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、血小板、

2、腫瘤細胞以及樹突狀細胞等。Exosome內(nèi)部富含MHCⅠ和MHCⅡ類復合體、T淋巴細胞共刺激分子等。 有報道稱腫瘤抗原肽沖擊的樹突狀細胞分泌的exosomes可在小鼠體內(nèi)特異性的激活細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，抑制腫瘤的生長，甚至能徹底消滅小鼠體內(nèi)腫瘤細胞。以exosomes為基礎的亞細胞結構的腫瘤疫苗提供了一種可以替代樹突狀細胞的腫瘤生物治療模式。 在體外，用腫瘤細胞總RNA轉染樹突狀細胞能夠激發(fā)出強大的、T淋巴細胞

3、介導的抗腫瘤免疫反應。本實驗提取人胃腺癌BGC-823細胞和人白血病K562細胞總RNA，轉染人臍血來源的樹突狀細胞后，提取樹突狀細胞培養(yǎng)上清液中的exosomes，觀察其能否誘導出特異性抗腫瘤效應。 方法；1臍血來源DC體外誘導擴增采用四步梯度離心法從臍血中分離單個核細胞(MNC)后，以含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)，2h后貼壁細胞為單核細胞，加入細胞因子rhGM-CSF(50ng/ml)，rhIL-4(10ng/ml

4、)誘導分化。2T細胞的分離和誘導方法1中非貼壁細胞用含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，并加入rhIL-2(5ng/ml)。 3總RNA制備及鑒定參照RNA提取試劑Trizol說明書將處于對數(shù)生長期的BGC-823細胞和K562細胞抽提總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，紫外分光光度儀測定A260/A280數(shù)值。 4總RNA轉染DC參照陽離子脂質(zhì)體LIPOFECTAMINE2000試劑說明書，用腫瘤細胞總

5、RNA轉染DC。 5轉染后DC行透射電鏡分析。 6轉染前后DC表面標志變化取轉染前培養(yǎng)5d未成熟DC及培養(yǎng)第8d分別轉染兩種腫瘤細胞總RNA后DC，流式細胞儀(FCM)檢測DC表面標志性標志物CD54、CD80、CD86、HLA-DR的表達水平。 7四步離心法提取exosomes。8exosomes的透射電鏡分析滴20-30μlexosomes懸液于載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置1h，用濾紙從側面吸干液體，滴加20ml/L

6、磷鎢酸溶液約30μl于銅網(wǎng)上，室溫負染1min，濾紙吸干負染液，白熾燈下烤干約10min,透射電鏡下觀察照相。 9MTT法檢測exosomes激活的CTL對腫瘤細胞的殺傷活性exosomes激活的CTL作為效應細胞，腫瘤細胞作為靶細胞，效靶比分別為10∶1和20∶1。并設效應細胞對照組和靶細胞對照組，每組均設3個復孔。殺傷活性=[靶細胞對照組A值-(實驗組A值-效應對照組A值)]/靶細胞對照組A值×100％。 10采用S

7、PSS11.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，所獲數(shù)據(jù)均用±s表示，組間比較采用配對t檢驗。 結果；1培養(yǎng)8d后，通過光鏡和透射電鏡觀察可見典型的樹突狀細胞形態(tài)。 2通過紫外分光光度計測得OD260/280=1.87，證明提取的RNA較為純凈。經(jīng)RNA電泳，呈現(xiàn)5S，18S，28S3條完整條帶而無其他雜帶干擾，也無拖尾現(xiàn)象，證明RNA未降解。 3DC轉染后72h，在CD54、CD80、CD86、HLA-DR等成熟標志的

8、表達上均有顯著升高。 4MTT法檢測exosomes激活的CTL和未經(jīng)exosomes激活的CTL對BGC-823細胞和K562細胞的殺傷率，激活組殺傷率明顯高于未激活組，證明RNA轉染DC泌exosomes具有強大的激活CTL的能力。 結論；通過本實驗的研究，可得出如下結論：轉染了腫瘤細胞總RNA的DC分泌的exosomes具有強大的激活CTL的能力，經(jīng)實驗證明，激活的CTL在體外對腫瘤細胞有特異性殺傷活性，無論是實體