POMC神經(jīng)元在回腸轉(zhuǎn)位術(shù)緩解2型糖尿病中的作用和機(jī)制.pdf

1、第一部分回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對非肥胖2型糖尿病的緩解作用
　　 背景
　　 2型糖尿病(Type2diabetesmellitus，T2DM)是在世界范圍內(nèi)廣泛流行的危害人類健康的重要疾病，目前全球患者人數(shù)估計在2.8億人左右，并且發(fā)病率逐年上升，預(yù)計到2030年時患者人數(shù)將超過3.6億人。到目前為止還沒有根治2型糖尿病的方法，當(dāng)前的治療方法包括飲食，運動，口服降糖藥，注射胰島素等措施目的在于控制血糖，預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生。盡管通過嚴(yán)

2、格地控制血糖，能明顯降低糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率，但是由于患者依從性的差異，糖尿病仍造成較高的致殘率和致死率。越來越多的動物及臨床研究表明各種減肥手術(shù)，特別是回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對2型糖尿病有較好的緩解作用。但是其機(jī)制目前還不明確，主要的解釋有:減肥效果帶來的抗糖尿病作用和不依賴減肥效果的抗糖尿病作用。后者是指胃腸道結(jié)構(gòu)改變引起的胃腸道激素的變化所造成的血糖的改善，還可分為前腸假說和后腸假說。每種解釋都相互獨立，各有傾向。目前越來越多的2型糖尿病是非

3、肥胖或者是不伴有病態(tài)肥胖的患者，對于非肥胖2型糖尿病患者，回腸轉(zhuǎn)位術(shù)是否仍然存在確切的改善作用呢？沒有了明顯的減肥效果，其血糖的改善到底是哪種機(jī)制主導(dǎo)的呢？其之間有沒有相互作用？
　　 為了探討回腸轉(zhuǎn)位術(shù)是否對非肥胖2型糖尿病有緩解作用，并討論其緩解機(jī)制，本研究構(gòu)建了非肥胖2型糖尿病回腸轉(zhuǎn)位術(shù)動物模型。通過手術(shù)組與假手術(shù)組動物模型的比較，觀察糖尿病的改善狀況。并通過對代表各個機(jī)制假說重要激素等指標(biāo)變化的對比與分析，討論術(shù)后糖尿病

4、改善的機(jī)制。
　　 方法
　　 本研究采用非肥胖2型糖尿病GK大鼠作為動物模型，隨機(jī)分為3組:回腸轉(zhuǎn)位術(shù)組(IT組)、回腸轉(zhuǎn)位假手術(shù)組(S-IT組)、及空白對照組?；啬c轉(zhuǎn)位術(shù)是將距離回盲部5cm的一段10cm的回腸上提到距離Treiz韌帶10cm處吻合;假手術(shù)組給予同樣的橫斷位置，但是原位吻合。然后比較術(shù)前及術(shù)后各個實驗組之間大鼠的攝食量及體重的變化、血糖狀況、β細(xì)胞功能、瘦素水平、GLP-1水平及GIP水平等檢測指標(biāo)的

5、變化。
　　 結(jié)果
　　 1.術(shù)后IT組和S-IT組大鼠的進(jìn)食量和體重都明顯下降（P＜0.05），但是S-IT組大鼠的攝食量和體重在術(shù)后迅速回升，到術(shù)后第8周時與空白對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。而IT組大鼠的攝食量及體重一直維持在較低水平，始終低于S-IT組及空白對照組(P＜0.05）。
　　 2.術(shù)后2周內(nèi)IT組和S-IT組的血糖及口服葡萄糖耐量實驗的AUCoGTT低于術(shù)前(P＜0.05)，但是S-IT

6、組的血糖后期與空白對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，而IT組大鼠的血糖及AUCoGTT都顯著低于S-IT組及空白對照組（P＜0.05）。
　　 3.對胰島素耐量實驗各個時間點血糖的比較，術(shù)后IT組非肥胖2型糖尿病大鼠的胰島素抵抗得到顯著的改善(P＜0.05);S-IT組大鼠的胰島素抵抗無明顯改善，并進(jìn)行性惡化，與空白對照組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 4.通過空腹C-肽、空腹胰島素的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA

7、)檢測及葡萄糖-胰島素釋放實驗發(fā)現(xiàn):IT組非肥胖2型糖尿病大鼠β細(xì)胞分泌胰島素的量增加（P＜0.05），而S-IT組和空白對照組在術(shù)前術(shù)后無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 5.IT組非肥胖2型糖尿病大鼠術(shù)后的空腹GLP-1水平增高，糖負(fù)荷后GLP-1分泌量增多（P＜0.05）。而S-IT組和空白對照組在術(shù)前術(shù)后無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 6.3組大鼠的空腹GIP及糖負(fù)荷后GIP分泌量術(shù)前及術(shù)后均無統(tǒng)計學(xué)差異

8、(P＞0.05)。
　　 7.IT組非肥胖2型糖尿病大鼠術(shù)前及術(shù)后的空腹瘦素均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但是糖負(fù)荷后AUCL。ptin升高明顯（P＜0.05）?？瞻讓φ战M術(shù)后36周的空腹瘦素比術(shù)前高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 本部分實驗證實:
　　 1.回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對非肥胖2型糖尿病大鼠有明顯、持久的抑制攝食的作用，使其體重增加得緩慢。
　　 2.回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對非肥胖2型糖尿病大鼠的血糖

9、有迅速、明顯、持久的改善作用。
　　 3.探究回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對非肥胖2型糖尿病大鼠血糖改善的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn):回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對非肥胖2型糖尿病大鼠的胰島素抵抗有顯著和持久的改善作用，并且對非肥胖2型糖尿病大鼠的β細(xì)胞有改善作用，使胰島素分泌量增加。
　　 4.對相關(guān)激素檢測發(fā)現(xiàn):回腸轉(zhuǎn)位術(shù)后非肥胖2型糖尿病大鼠的血GLP-1水平增高，GIP分泌量術(shù)前及術(shù)后相比無統(tǒng)計學(xué)差異，瘦素分泌量的變化不大，但是瘦素分泌的敏感性改善了。統(tǒng)計學(xué)分析

10、，GLP-1水平的升高對血糖的影響較大，呈線性相關(guān)。GIP及瘦素的改變對IT手術(shù)改善血糖的影響無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 上述發(fā)現(xiàn)表明，回腸轉(zhuǎn)位術(shù)能顯著改善非肥胖2型糖尿病患者的血糖，改善胰島素抵抗，增加β細(xì)胞的胰島素分泌量。對有關(guān)參與回腸轉(zhuǎn)位術(shù)改善血糖機(jī)制可能激素的統(tǒng)計學(xué)分析顯示，手術(shù)引起的GLP-1分泌增加發(fā)揮著主要作用。有關(guān)GLP-1的作用機(jī)制及下一步作用位點，尚待更深入的研究。
　　 第二部分下丘腦POMC神經(jīng)元在回腸

11、轉(zhuǎn)位術(shù)緩解非肥胖2型糖尿病中的作用
　　 背景
　　 代謝綜合征是多種代謝成分異常聚集的病理狀態(tài)，葡萄糖代謝異常是其中一種表現(xiàn)。生理狀態(tài)下哺乳動物的個體都處于精確的能量自動平衡中。下丘腦是調(diào)節(jié)機(jī)體能量活動的重要部位，有著許多的神經(jīng)核團(tuán)，參與著復(fù)雜的神經(jīng)生理活動。POMC神經(jīng)元作為存在于下丘腦的一類重要的神經(jīng)元，可以抑制肥胖，產(chǎn)生較強的厭食感，被認(rèn)為是食欲相關(guān)肽神經(jīng)元，調(diào)控著攝食和機(jī)體能量平衡。該神經(jīng)元分泌的POMC及其衍

12、生肽等被認(rèn)為是抑制攝食和增加能量消耗的肽類物質(zhì)。POMC缺陷的大鼠常常伴有肥胖及糖尿病的癥狀。生理狀態(tài)下POMC神經(jīng)元可以被升高的GLP-1所激活，也能被降低的血糖水平所抑制?；啬c轉(zhuǎn)位術(shù)使得非肥胖2型糖尿病大鼠術(shù)后GLP-1的水平升高，但是血糖水平降低。其POMC神經(jīng)元是被激活還是抑制？回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對2型糖尿病的改善作用是不是通過POMC神經(jīng)元發(fā)揮作用的？到目前為止還沒有相關(guān)的報道。
　　 因此本研究通過構(gòu)建好的2型糖尿病回腸轉(zhuǎn)位

13、術(shù)模型，觀察下丘腦中激活的POMC神經(jīng)元數(shù)量及POMC翻譯和表達(dá)的量。通過對回腸轉(zhuǎn)位手術(shù)組與其他組動物模型的比較，探討POMC神經(jīng)元在2型糖尿病血糖改善中的作用，為揭示2型糖尿病發(fā)病機(jī)制及回腸轉(zhuǎn)位術(shù)緩解2型糖尿病機(jī)制提供線索。
　　 方法
　　 將本實驗第一部分存活的3組GK大鼠，在術(shù)后36周時處死，采集下丘腦組織和腦脊液等標(biāo)本。免疫組織化學(xué)染色觀察POMC神經(jīng)元，對比組間大鼠下丘腦POMC神經(jīng)元的個數(shù);測量下丘腦POM

14、C的mRNA轉(zhuǎn)錄量和POMC多肽的表達(dá)量;測量腦脊液中GLP-1、胰島素和瘦素的含量，比較組間是否有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果
　　 1.接受回腸轉(zhuǎn)位術(shù)的非肥胖2型糖尿病大鼠，術(shù)后36周下丘腦組織POMCmRNA的量比S-IT組和空白對照組都高(P＜0.05），而S-IT組與空白對照組相比沒有顯著的差異（P＞0.05）。
　　 2.IT組大鼠下丘腦POMC多肽含量比S-IT組高1.5倍(P＜0.05），比空白對照組

15、高1.6倍(P＜0.05），S-IT組與空白對照組相比沒有顯著的差異（(P＞0.05）。
　　 3.IT組大鼠丘腦的POMC神經(jīng)元個數(shù)多于假手術(shù)組和空白對照組(P＜0.05)。
　　 4.經(jīng)過ELISA檢測，IT組大鼠腦脊液中GLP-1的濃度顯著高于S-IT組大鼠及空白對照組大鼠（P＜0.05）。
　　 5.IT組、S-IT組和空白對照組大鼠腦脊液中胰島素的濃度無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05）。
　　 6.I

16、T組、S-IT組和空白對照組大鼠腦脊液中瘦素水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 結(jié)論
　　 本部分實驗證實:
　　 1.回腸轉(zhuǎn)位術(shù)后非肥胖2型糖尿病大鼠下丘腦組織POMCmRNA的轉(zhuǎn)錄增多，POMC多肽表達(dá)增多。
　　 2.接受回腸轉(zhuǎn)位術(shù)的非肥胖2型糖尿病大鼠下丘腦組織POMC神經(jīng)元的數(shù)量增多。根據(jù)POMC神經(jīng)元及POMC的作用，它可能參與回腸轉(zhuǎn)位術(shù)改善血糖的機(jī)制。
　　 3.進(jìn)一步探討PO

17、MC被激活的原因，回腸轉(zhuǎn)位術(shù)引起的GLP-1分泌增加可能發(fā)揮著主要作用。
　　 該實驗首次將神經(jīng)元作用與回腸轉(zhuǎn)位術(shù)改善糖尿病聯(lián)系在一起，發(fā)現(xiàn)其改變及可能的機(jī)制，為研究2型糖尿病及手術(shù)改善糖尿病提供新的思路。
　　 第三部分下丘腦POMC神經(jīng)元在回腸轉(zhuǎn)位術(shù)緩解非肥胖2型糖尿病中的機(jī)制
　　 背景
　　 POMC神經(jīng)元被認(rèn)為是食欲相關(guān)肽神經(jīng)元，調(diào)控著攝食和機(jī)體能量平衡。它能夠接受來自外周的信號，如:迷走神經(jīng)傳

18、導(dǎo)的來自口咽、胃腸牽張感覺及肝臟代謝活動等所形成的刺激作用;循環(huán)中胃腸道分泌的腦腸肽及各種營養(yǎng)物質(zhì)本身等。通過對這些信號的感知、整合反饋成腦內(nèi)神經(jīng)因子的形式。這些神經(jīng)因子與其他的神經(jīng)元相互聯(lián)系，形成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，對機(jī)體實時精確的應(yīng)答反應(yīng)。前部分實驗發(fā)現(xiàn)IT手術(shù)后的大鼠血及腦脊液中GLP-1的水平明顯增高。鑒于GLP-1可以通過自由擴(kuò)散穿過血腦屏障，并且POMC神經(jīng)元上有GLP-1的受體，因此可以推斷POMC神經(jīng)元可能被升高的GLP-1所激活

19、。但是非肥胖2型糖尿病被回腸轉(zhuǎn)位術(shù)所緩解的機(jī)制是否有激活的POMC神經(jīng)元參與呢？
　　 為了更好地探討下丘腦POMC神經(jīng)元在回腸轉(zhuǎn)位術(shù)緩解非肥胖2型糖尿病中的機(jī)制，我們在接受側(cè)腦室置管的非肥胖2型糖尿病大鼠中重新構(gòu)建了回腸轉(zhuǎn)位術(shù)模型。比較術(shù)前及術(shù)后腦脊液中多個時間點GLP-1水平的變化及血糖的變化，并且在大鼠側(cè)腦室中給予GLP-1受體的拮抗劑Exendin(9-39)，觀察拮抗后大鼠2型糖尿病的癥狀及POMC神經(jīng)元的變化。

20、>　　 方法
　　 采用非肥胖2型糖尿病GK大鼠作為動物模型，給予大鼠側(cè)腦室置管術(shù)，將存活的GK大鼠隨機(jī)分為如下2組:IT組和S-IT組。術(shù)前及術(shù)后各個時間點監(jiān)測體重、攝食、血糖及GLP-1等多個指標(biāo)。
　　 在回腸轉(zhuǎn)位術(shù)后4周時，對兩組大鼠同時進(jìn)行側(cè)腦室GLP-1拮抗劑Exendin(9-39)的注射，然后比較兩組大鼠的血糖及攝食等指標(biāo)，觀察GLP-1受體被拮抗后回腸轉(zhuǎn)位術(shù)改善血糖的效果有無改變。術(shù)后6周處死所有大鼠

21、，處死之前對IT組大鼠給同樣劑量的Exendin(9-39)，收集大鼠下丘腦等組織，組間觀察比較GLP-1受體被拮抗后POMC神經(jīng)元的狀態(tài)。
　　 結(jié)果
　　 1.接受側(cè)腦室置管的非肥胖2型糖尿病大鼠給予回腸轉(zhuǎn)位術(shù)和假回腸轉(zhuǎn)位術(shù)，術(shù)后4周IT組大鼠7只大鼠S-IT組5只大鼠一直存活到實驗結(jié)束，但是IT手術(shù)組僅有6只大鼠的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
　　 2.兩組大鼠術(shù)前的體重及攝食量無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05）?；啬c轉(zhuǎn)位術(shù)后IT

22、組大鼠的進(jìn)食量顯著低于S-IT組大鼠，體重也明顯低于S-IT大鼠(P＜0.05)。
　　 3.兩組大鼠的血糖及AUCoGTT術(shù)前無顯著性差異(P＞0.05），回腸轉(zhuǎn)位術(shù)后都出現(xiàn)了不同程度的血糖下降。IT組大鼠的血糖下降后始終處于較為平穩(wěn)的狀態(tài)，低于術(shù)前血糖水平(P＜0.05);S-IT組大鼠的血糖下降后呈現(xiàn)緩慢回升的趨勢，與術(shù)前比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。AUCoGTT曲線變化同血糖變化一致。IT組大鼠的AUCoGTT在下

23、降后始終處于較低的狀態(tài)，而S-IT組大鼠的AUCoGTT降低的不明顯（P＞0.05）。驗證了回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對非肥胖2型糖尿病的緩解作用。
　　 4.回腸轉(zhuǎn)位術(shù)后IT組大鼠腦脊液GLP-1水平不斷升高，顯著高于術(shù)前水平(P＜0.05)。但是S-IT組GLP-1的水平波動不大，術(shù)后與術(shù)前水平相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 5.回腸轉(zhuǎn)位術(shù)后4周注射Exendin(9-39)前，IT組大鼠的攝食量比S-IT組大鼠少(P＜0

24、.05）。注射后IT組大鼠的攝食量明顯增加(P＜0.05），與S-IT組大鼠的攝食量相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。S-IT組大鼠的攝食量與注射前相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。注射前后兩組大鼠的體重均無統(tǒng)計學(xué)變化(P＞0.05)。
　　 6.注射Exendin(9-39)前，IT組大鼠的血糖低于S-IT組大鼠的血糖(P＜0.05）。注射Exendin(9-39)后，IT組大鼠的血糖升高(P＜0.05），與S-IT組無統(tǒng)計學(xué)

25、差異（P＞0.05）。S-IT組大鼠的血糖注射前后相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。OGTT實驗也發(fā)現(xiàn)注射Exendin(9-39)后，IT組大鼠的血糖峰值與S-IT組大鼠無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 7.回腸轉(zhuǎn)位術(shù)后6周注射Exendin(9-39)后IT組大鼠的下丘腦組織POMCmRNA的量比S-IT組低(P＜0.05）。
　　 8.術(shù)后6周注射Exendin(9-39)后IT組大鼠的下丘腦組織POMC多肽含

26、量比S-IT組低(P＜0.05)。
　　 9.術(shù)后6周注射Exendin(9-39)后IT組大鼠丘腦的POMC神經(jīng)元個數(shù)少于S-IT組（P＜0.05）。
　　 10.術(shù)后6周注射Exendin(9-39)后IT組大鼠腦脊液中GLP-1的濃度高于S-IT組大鼠（P＜0.05）。胰島素的濃度無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。
　　 結(jié)論
　　 本部分的實驗結(jié)果表明:
　　 1.通過建立側(cè)腦室置管的非肥胖2

27、型糖尿病大鼠回腸轉(zhuǎn)位術(shù)和假回腸轉(zhuǎn)位術(shù)模型，再一次證實了回腸轉(zhuǎn)位術(shù)對非肥胖2型糖尿病的治療作用。攝食量減少，血糖及AUCoGTT得到明顯的改善。
　　 2.回腸轉(zhuǎn)位術(shù)后非肥胖2型糖尿病大鼠腦脊液GLP-1隨術(shù)后時間不斷升高，顯著高于術(shù)前水平。
　　 3.術(shù)后注射GLP-1受體拮抗劑Exendin(9-39)能使非肥胖2型糖尿病大鼠已經(jīng)改善的糖尿病癥狀惡化，血糖升高，攝食量增加。
　　 4.術(shù)后注射Exendin(9