α2-腎上腺素受體介導鎮(zhèn)靜作用的機制研究.pdf

1、α2-腎上腺素受體（α2-Adrenoceptor，α2-AR）是經典的腎上腺素能受體之一，屬A類G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCR）超家族，內源性配基為去甲腎上腺素（Noradrenaline，NE）和腎上腺素（Epinephrine），廣泛分布在外周組織和中樞神經系統(tǒng)中，參與介導多種生理功能，如鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、降低血壓和體溫等，是藥物開發(fā)的重要靶點。右美托咪啶（Dexmedetomidine

2、，DMED）為α2-AR激動劑，其鎮(zhèn)靜作用與生理性睡眠相似，在臨床麻醉以及ICU的鎮(zhèn)靜中廣泛應用。α2-AR的三個亞型α2A-AR、α2B-AR和α2C-AR，在體內分布明顯不同，并且每個亞型介導哪些生理功能尚不完全清楚。右美托咪啶激活α2-AR后引起的鎮(zhèn)靜作用是否具有亞型特異性？右美托咪啶激活α2-AR受體后與Gαi蛋白偶聯(lián)，引起一系列下游信號通路的變化，這些變化的受體后信號通路與鎮(zhèn)靜作用又有何聯(lián)系？為了回答這些問題，本課題開展如下研

3、究。
　　研究目的：
　　明確α2-AR受體激活后發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用的關鍵受體亞型及參與鎮(zhèn)靜作用的主要受體后信號通路。
　　研究內容：
　　1、在細胞水平上，建立α2-AR受體亞型藥物篩選模型，并對多種α2-AR激動劑或拮抗劑進行藥效學評價；在整體水平上，探究DMED激動α2-AR后發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用與受體亞型的相關性。
　　2、在整體水平上，探究DMED激動α2-AR后發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用的信號通路機制。研究方法：
　

4、　1、構建 pcDNA3.1/Hygro-HA-α2A-AR及pcDNA3.1/Hygro-HA-α2C-AR重組質粒，轉染至CHO-PKAcat-EGFP細胞中，以潮霉素B（200 mg/L）進行壓力篩選后，采用 PKA重分布實驗篩選陽性克隆，建立 CHO-PKAcat-α2A-AR及CHO-PKAcat-α2C-AR穩(wěn)定轉染細胞株，通過計算陽性克隆 Z'因子，驗證模型可靠性。
　　2、通過實時定量 PCR（qRT-PCR）法驗

5、證細胞模型中兩個受體亞型在轉錄水平的表達量，放射性配體結合實驗檢測受體蛋白表達豐度，最后以時間分辨熒光共振能量轉移免疫實驗檢測細胞cAMP含量以鑒定α2-AR受體亞型的功能。
　　3、在CHO-PKAcat-α2A-AR及CHO-PKAcat-α2C-AR兩個細胞模型上，用PKA重分布實驗對α2-AR的七種激動劑DMED、美托咪啶（Medetomidine， MED）、可樂定、NE、胍法辛、賽拉嗪、莫索尼定以及六種拮抗劑阿替美唑（

6、Atipamezole， ATI）、BRL44408、JP-1302、ARC239、哌唑嗪進行藥效學評價。
　　4、通過小鼠翻正反射消失（Loss of righting reflex，LORR）模型、小鼠自發(fā)活動模型評價靜脈給予DMED的鎮(zhèn)靜作用。觀察小鼠側腦室注射不同的α2-AR拮抗劑阿替美唑、BRL44408、JP-102、ARC239對DMED鎮(zhèn)靜作用的影響。
　　5、評價α2-AR不同激動劑DMED、可樂定、胍法辛

7、和賽拉嗪對小鼠自發(fā)活動的影響；通過麻醉大鼠在體檢測 DMED、可樂定、胍法辛和賽拉嗪對大鼠血壓及心率的影響，排除血壓對自發(fā)活動的影響。在小鼠翻正反射及自發(fā)活動模型上，觀察小鼠側腦注射 cAMP類似物二丁酰 cAMP鈉鹽（Dibutyryl-cAMP， dbcAMP）以及內向整流鉀通道阻斷劑 Tertiapin-Q三氟乙酸鹽（ Tertiapin-Q trifluoroacetate salt，T-Q）對DMED鎮(zhèn)靜作用的影響。
　

8、　研究結果：
　　1、酶切鑒定與基因測序證明 pcDNA3.1/Hygro-HA-α2A-AR及pcDNA3.1/Hygro-HA-α2C-AR重組質粒構建成功。重組質粒轉染細胞后，PKA重分布實驗篩選出反應性良好的CHO-PKAcat-α2A-AR7號克隆及CHO-PKAcat-α2C-AR60號克隆，兩株細胞的Z'因子經多次重復試驗均在0.5~1之間，證明CHO-PKAcat-α2A/2C-AR穩(wěn)定轉染細胞模型可靠性良好。

9、r>　　2、α2A-AR及α2C-AR的mRNA含量在CHO-PKAcat-α2A/2C-AR穩(wěn)定轉染細胞株多次傳代后保持穩(wěn)定的較高水平；CHO-PKAcat-α2A-AR細胞中，[3H]RX821002與α2A-AR結合的Bmax值和Kd值分別為（4.92±5.27）pmol/mg和（12.67±11.16）nM；CHO-PKAcat-α2A-AR細胞中，F(xiàn)orskolin（10μM）可明顯增加胞內cAMP含量，DMED（10-6～1

10、0-4 M）作用后可顯著抑制forskolin的作用。Forskolin（10μM）作用于CHO-PKAcat-EGFP及CHO-PKAcat-α2C-AR細胞后， cAMP明顯增加， DMED（10-8～10-4 M）作用后有劑量依賴的降低CHO-PKAcat-α2C-AR細胞cAMP含量趨勢，在DMED為10-4 M時與forskolin對照組有顯著差異，表明激動劑能夠激活CHO-PKAcat-α2A/2C-AR穩(wěn)定轉染細胞株的受體

11、后通路，受體能夠發(fā)揮正常功能。
　　3、在CHO-PKAcat-α2A/2C-AR穩(wěn)定轉染細胞模型上，通過PKA重分布實驗比較不同的α2-AR激動劑和拮抗劑對兩受體的激動和拮抗作用，根據EC50或IC50值比較它們對兩種亞型的選擇性。七種激動劑對于兩種受體均無明顯選擇性，其中DMED對兩種受體的作用效能均強于其他激動劑；拮抗劑阿替美唑對兩個亞型拮抗作用較強且無選擇性，而 BRL44408則表現(xiàn)出了明顯的α2A-AR選擇性（IC50

12、=242.30±26.00 nM），JP-1302對α2C-AR具有選擇性（IC50=2813.00±521.64 nM），ARC239在濃度為10-5 M時能夠拮抗DMED對α2C-AR的作用。
　　4、DMED（0.1~0.22 mg/kg，i.v）可劑量依賴性地引起小鼠翻正反射消失， ED50=0.12 mg/kg，ED100=0.22 mg/kg，不同劑量組對誘導時間的影響無顯著差異，制動時間有劑量依賴性延長的趨勢，但無統(tǒng)

13、計學意義；DMED可以劑量（0.000391~0.1 mg/kg）依賴性地抑制小鼠自發(fā)活動，其中，0.00625~0.1 mg/kg劑量下與空白對照組相比有顯著性差異。以DMED（0.25 mg/kg，i.v）建立小鼠翻正反射消失模型，ATI（0.05~1μg/只，i.c.v）可以劑量依賴性地拮抗DMED致小鼠翻正反射消失的作用；α2A-AR選擇性拮抗劑BRL44408（2.5~20μg/只， i.c.v）也可以劑量依賴地拮抗 DMED

14、的作用，各劑量對誘導時間的影響無明顯統(tǒng)計學差異，但可以顯著降低制動時間；α2C-AR選擇性拮抗劑ARC239（48μg/只）、JP-1302（88μg/只）腦室給藥不能拮抗DMED的作用。以DMED（0.0125 mg/kg，i.v）建立小鼠自發(fā)活動抑制模型，ATI（0.2、0.8、3.2μg/只，i.c.v）單獨給藥對小鼠自發(fā)活動無影響，0.8及3.2μg/只劑量均可以顯著拮抗DMED對小鼠的自發(fā)活動抑制作用；BRL44408（2.5

15、、5、10μg/只，i.c.v）對小鼠自發(fā)活動有劑量依賴的抑制趨勢，但無顯著性差異，5μg/只劑量組可以顯著拮抗DMED的作用，10μg/只劑量組不能拮抗DMED的作用，自身有抑制自發(fā)活動的作用；JP-1302（5.5、22、88μg/只，i.c.v）對小鼠自發(fā)活動有抑制的趨勢，但無統(tǒng)計學差異，對DMED抑制小鼠自發(fā)活動沒有對抗作用；ARC239（3、12、48μg/只， i.c.v）對小鼠的自發(fā)活動有劑量依賴的抑制趨勢，尤其48μg/

16、只劑量下作用顯著，但三個劑量也都無法拮抗DMED抑制小鼠自發(fā)活動的作用。
　　5、DMED在0.05 mg/kg劑量下即可顯著抑制小鼠自發(fā)活動，而可樂定、胍法辛和賽拉嗪鎮(zhèn)靜作用較弱，藥效比較排序為DMED>可樂定>胍法辛≈賽拉嗪。DMED、可樂定、胍法辛及賽拉嗪對小鼠的自發(fā)活動抑制屬于中樞抑制后產生的鎮(zhèn)靜作用，與血壓降低無關。以DMED（0.20 mg/kg，i.v）建立小鼠翻正反射模型，dbcAMP（20~40μg/只，i.c.

17、v）劑量依賴地抑制DMED的作用，40μg/只可完全抑制DMED誘導的翻正反射消失，各劑量組誘導時間無顯著性差異，制動時間均明顯低于DMED組；T-Q（250、300 pmol/只，i.c.v）顯著抑制DMED的作用，各劑量組誘導時間無顯著性差異，制動時間隨劑量增加而逐漸降低。以DMED（0.0125 mg/kg，i.v）建立小鼠自發(fā)活動抑制模型，dbcAMP三個劑量（1.25、5、20μg/只，i.c.v）單獨給藥對小鼠自發(fā)活動有一定

18、的抑制作用，且不能拮抗DMED的作用；T-Q（40、100、250 pmol/只，i.c.v）三個劑量雖然單獨給藥對小鼠自發(fā)活動無影響，但也不能拮抗DMED的作用，與翻正反射模型的結果矛盾，其原因有待進一步研究。
　　結論：
　　1、成功建立CHO-PKAcat-α2A-AR及CHO-PKAcat-α2C-AR穩(wěn)定轉染細胞模型。
　　2、α2-AR拮抗劑BRL44408對α2A-AR具有選擇性，JP-1302及ARC2