米黑霉脂肪酶活性的高通量篩選方法及其固定化和應(yīng)用的研究.pdf

1、脂肪酶即甘油酯水解酶，是一類專門水解油脂的酯酶。脂肪酶廣泛應(yīng)用于化學(xué)合成、食品、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)保和能源開發(fā)等領(lǐng)域。其中來源于真菌米黑霉的脂肪酶RML（Rhizomucor miehei Lipase）是1，3-位專一性的脂肪酶，可以有效得制備各類油脂。
　　 在本文中，首先介紹了檢測(cè)脂酶活性的幾種方法及RML的一些酶學(xué)特性。其中p-NPP法只適合檢測(cè)低酶活的脂酶;醋酸銅法和堿滴定法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但都適于檢測(cè)脂酶酶活。RML在溫度35

2、-38℃，pH8-10之間表現(xiàn)出較好的活性。Cu2+抑制RML的活性，而Ca2+和Mg2+都能促進(jìn)RML的活性。
　　 其次，開發(fā)了一種以橄欖油為催化底物的高通量篩選方法，并用于脂肪酶RML的定向進(jìn)化。這個(gè)高通量方法的原理是利用脂肪酸和氯化鈣反應(yīng)生成可以通過pH指示劑檢測(cè)的鹽酸。與傳統(tǒng)的p-NPP法比較，這個(gè)新方法展現(xiàn)了很多的優(yōu)點(diǎn):首先反應(yīng)真實(shí)底物的活性;其次克服了p-NPP方法只能檢測(cè)低酶活的缺點(diǎn)。新方法篩選出的突變酶，通過滴

3、定法及液相檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)活性確實(shí)有所提高，而用p-NPP法篩選出的突變酶卻不完全一致。通過運(yùn)用該方法，RML經(jīng)兩輪定向進(jìn)化后，我們成功篩選到酶活提高了5倍的優(yōu)勢(shì)菌。另外，脂酶的酯化活性也會(huì)隨著水解活性提高。脂酶RML的1，3-位專一性沒有改變。
　　 磁性納米顆粒因其生物相容性、穩(wěn)定性、特殊磁性和比表面積大而受到廣泛的關(guān)注。通過丙烯酸乙酯與磁性Fe3O4的共聚反應(yīng)，建立了一個(gè)在磁性納米載體上共價(jià)結(jié)合固定化酶的方法。因?yàn)檫@個(gè)方法利用疊

4、氮基固定化酶，不接觸任何化學(xué)物質(zhì)，所以避免了酶失活等問題。每克Fe3O4酶的裝載量達(dá)到250毫克，而且保留活性為100％左右。即使重復(fù)使用10次，活性仍不變。
　　 1，3-甘油二酯(1，3-DAG)由于其廣泛用途，尤其是對(duì)身體健康方面的作用而日益受到人們的重視。在本文中介紹了用酶法制備1，3-DAG的一些方法。其中通過脂酶RML酯化甘油和脂肪酸得到86％的油酸轉(zhuǎn)化率和91％純度的1，3-DAG。通過脂酶RML的酯化和水解作用，