柔腦膜細胞具有神經(jīng)干細胞特性的實驗研究.pdf

1、長期以來腦膜被視為是僅具有保護作用的非神經(jīng)組織，在結(jié)構(gòu)和功能上與腦實質(zhì)有本質(zhì)的不同，但在上世紀90年代Mercier等應用形態(tài)學方法清晰地勾勒出柔腦膜細胞與腦實質(zhì)內(nèi)膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元之間有網(wǎng)狀的復雜聯(lián)系，從而提出柔腦膜細胞參與腦內(nèi)某些生理或病理過程的可能性，引發(fā)了對柔腦膜功能的深入思考。新近的一些研究發(fā)現(xiàn)：腦膜中的柔腦膜細胞(leptomeningealcells)表達和分泌多種細胞因子和生物活性物質(zhì)，參與中樞的免疫調(diào)節(jié)和誘導發(fā)育神經(jīng)元的

2、遷移定位，并與小腦功能的完善及腦內(nèi)酶屏障的構(gòu)成密切相關(guān)。
　　但是，柔腦膜細胞與神經(jīng)元生長、分化的關(guān)系還存在爭議。有研究認為柔腦膜細胞分泌的抑制神經(jīng)突起生長的因子是神經(jīng)元損傷后修復的障礙；也有研究指出柔腦膜細胞能分泌神經(jīng)生長因子等多種促神經(jīng)突起再生的因子，并作為滋養(yǎng)層支持神經(jīng)干細胞的體外生長。新近的研究還注意到成年大鼠柔腦膜層有神經(jīng)干細胞標記物Lex/ssea-1的表達。這些結(jié)果提示柔腦膜細胞與神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復、尤其與神經(jīng)干細胞之

3、間可能存在著某種特殊聯(lián)系，為進一步探索柔腦膜細胞的功能提供了新思路。
　　針對以上問題，我們以柔腦膜細胞為研究對象，設計了五組實驗，從在體和體外細胞培養(yǎng)的角度，結(jié)合應用柔腦膜鋪片、細胞培養(yǎng)、免疫組織化學染色、免疫熒光標記、BrdU摻入實驗、Westernblot等研究方法，對柔腦膜細胞可能具有的神經(jīng)干細胞特性做了初步探討。第一組實驗觀察了正常成年以及不同生長發(fā)育期大鼠腦內(nèi)柔腦膜細胞是否表達經(jīng)典的神經(jīng)干細胞標志巢蛋白（nestin）

4、；第二組實驗在成功建立單純?nèi)崮X膜細胞培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，檢測了柔腦膜細胞能否表現(xiàn)出自我更新以及多向分化等神經(jīng)干細胞的生物特性；第三組至第五組實驗分別觀察了不同調(diào)控因素（白細胞介素-6、抗抑郁藥物以及機械損傷）對于柔腦膜來源神經(jīng)干細胞增殖分化的影響。
　　主要結(jié)果有：
　　實驗一
　　一、正常成年SD大鼠及Balb/c小鼠的柔腦膜層中均可檢測到神經(jīng)干細胞特異性標記物nestin的表達，但表達水平低，主要局限于腦腹側(cè)及大腦鐮

5、兩側(cè)的腦膜組織。兩種動物柔腦膜組織中陽性細胞的形態(tài)與分布存在差異。
　　二、不同生長發(fā)育期SD大鼠的柔腦膜細胞中nestin蛋白表達水平隨生長發(fā)育呈進行性降低。柔腦膜鋪片中除nestin/Thy1.1雙標陽性的柔腦膜細胞外，也有GFAP/nestin陽性細胞存在。
　　以上結(jié)果說明，不同生長發(fā)育期SD大鼠的柔腦膜細胞均可表達神經(jīng)干細胞標志nestin，即具有神經(jīng)前體細胞的增殖潛能，但此潛能隨生長發(fā)育而進行性減弱。
　　

6、實驗二
　　一、比較腦膜組織在不同培養(yǎng)條件下柔腦膜細胞的純度，發(fā)現(xiàn)以DMEM/5％FCS/5％HS培養(yǎng)時，培養(yǎng)體系中除柔腦膜細胞外，還存在約30％的星形膠質(zhì)細胞和少量神經(jīng)元；以DMEM/1％FCS/9％HS培養(yǎng)時，柔腦膜細胞純度達90％以上，幾乎沒有神經(jīng)元沾染。后者繼續(xù)傳代可使其純度達97％以上，僅有極少數(shù)星形膠質(zhì)細胞存活。結(jié)果提示改變培養(yǎng)條件及多次傳代是建立單純?nèi)崮X膜細胞體系的有效方法。
　　二、檢測單純培養(yǎng)的柔腦膜細胞是

7、否具有神經(jīng)干細胞的基本生物學特性。發(fā)現(xiàn)：給予含生長因子EGF/bFGF的無血清條件性培養(yǎng)基后，柔腦膜細胞可自我增殖形成神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)，其成球性呈bFGF濃度依賴性；再以胎牛血清誘導分化，可見除Thy1.1陽性的柔腦膜細胞外，還可分化為β-tubulinIII、GFAP、RIP陽性的神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞；并且柔腦膜細胞經(jīng)多次傳代仍可形成克隆球及多向分化，但能力逐漸減弱。
　　以上結(jié)果說明，間充質(zhì)來源的柔腦膜細胞經(jīng)體外分離培養(yǎng)后能夠表現(xiàn)出自

8、我更新以及多向分化等神經(jīng)干細胞的基本生物學特性，并可分化形成神經(jīng)元。
　　實驗三
　　一、白細胞介素-6（IL-6）可以誘導柔腦膜來源的神經(jīng)球向神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞多向分化，并顯著提高分化神經(jīng)元的比例。以多種神經(jīng)元標記物鑒定分化神經(jīng)元性質(zhì)，提示其為5-HT陽性的未成熟神經(jīng)元。
　　二、免疫細胞化學染色及Westernblotting結(jié)果均提示，IL-6孵育可顯著上調(diào)其自身受體（IL-6Rα及gp130）在柔腦膜來源神經(jīng)球內(nèi)

9、的表達，為柔腦膜細胞感受IL-6信號并發(fā)生應答反應提供了形態(tài)學基礎(chǔ)。
　　三、上述體系中，IL-6也引起磷酸化ERK1/2及STAT3分子在柔腦膜來源神經(jīng)球中的表達。而分別給予其特異性抑制劑PD98059及AG490后，發(fā)現(xiàn)ERK1/2通路磷酸化的抑制可影響神經(jīng)球向神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞的分化，而STAT3通路磷酸化的抑制則以星形膠質(zhì)細胞分化的受抑為主。同時，STAT3分子磷酸化提示gp130處于活化狀態(tài)。
　　以上結(jié)果說明，細胞

10、因子IL-6可促進柔腦膜來源神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化，而分化神經(jīng)元呈5-HT反應陽性。IL-6刺激引起了其自身受體及磷酸化ERK1/2及STAT3信號分子在該細胞體系中的表達，提示上述細胞內(nèi)分子機制可能參與了柔腦膜細胞向神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞的分化。
　　實驗四
　　一、以抗抑郁藥物西酞普蘭孵育柔腦膜來源的神經(jīng)球，發(fā)現(xiàn)：西酞普蘭能夠維持神經(jīng)球的克隆化生長、促進細胞增殖，并引起細胞內(nèi)ERK1/2、STAT3信號分子磷酸化；以信號通路抑

11、制劑預處理的結(jié)果顯示，西酞普蘭誘導細胞增殖的效應表現(xiàn)為ERK1/2通路依賴性。
　　二、觀察西酞普蘭孵育對柔腦膜來源的已貼壁分化的神經(jīng)干細胞的影響，發(fā)現(xiàn)：西酞普蘭可促進神經(jīng)干細胞繼續(xù)分化，并顯著上調(diào)分化神經(jīng)元的比例；同時也引起了分化細胞內(nèi)磷酸化ERK1/2、STAT3分子的表達。以信號通路抑制劑預處理的結(jié)果顯示，上述體系中神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的分化分別表現(xiàn)為ERK1/2或STAT3通路依賴性。
　　以上結(jié)果說明，西酞普蘭可以誘導

12、柔腦膜來源神經(jīng)干細胞的增殖，也可促進其向神經(jīng)元分化。但是調(diào)控細胞增殖分化的機制不同，分別表現(xiàn)為ERK1/2通路或ERK1/2及STAT3通路依賴性。
　　實驗五
　　一、建立柔腦膜細胞的體外機械損傷模型，檢測機械損傷對細胞增殖及逆分化的影響。結(jié)果顯示：劃傷刺激促進了柔腦膜細胞增殖，但不能誘導其表達nestin蛋白；而含生長因子的無血清條件性培養(yǎng)基可誘導損傷細胞形成神經(jīng)球，后者在血清存在時向神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞分化。
　　二

13、、觀察損傷的柔腦膜細胞對正常星形膠質(zhì)細胞增殖及逆分化的影響，發(fā)現(xiàn)：損傷的柔腦膜細胞可以誘導正常星形膠質(zhì)細胞增殖并表達nestin，后者也可形成神經(jīng)球并向神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞分化。
　　以上結(jié)果說明，機械損傷雖然不能直接誘導柔腦膜細胞分化為神經(jīng)前體細胞，但可以刺激細胞分泌某些活性物質(zhì)，誘導與之共培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞增殖并逆分化為神經(jīng)前體細胞。并且，細胞微環(huán)境對于細胞能否表現(xiàn)出神經(jīng)干細胞特性具有重要意義。
　　結(jié)論：
　　本研究

14、從不同的角度證實：起源于間充質(zhì)組織的柔腦膜細胞能夠表現(xiàn)出神經(jīng)干細胞的基本特性，自我增殖并在適當條件下分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞；不同性質(zhì)的刺激（細胞因子、抗抑郁藥物以及機械損傷等）可調(diào)控其增殖分化；神經(jīng)系統(tǒng)損傷時，柔腦膜細胞可能分泌活性物質(zhì)而參與誘導腦內(nèi)內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖活化。根據(jù)以上結(jié)果，我們提出了腦膜細胞可能是腦內(nèi)潛在的神經(jīng)干細胞的觀點。這些初步發(fā)現(xiàn)將為我們更加全面、深入地認識柔腦膜細胞的功能奠定了基礎(chǔ)，為神經(jīng)損傷