白藜蘆醇對轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC34細(xì)胞的作用.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種選擇性累及上、下運(yùn)動神經(jīng)元的慢性進(jìn)行性致死性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。很多研究表明氧化應(yīng)激介導(dǎo)了神經(jīng)元的死亡并在神經(jīng)變性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,因此抗氧化應(yīng)激治療相應(yīng)地成為了治療ALS的一個重要方向。
　　 有研究發(fā)現(xiàn)在ALS患者的神經(jīng)組織中存在異常的TDP-43(TAR-DNAbinding protein)蛋白

2、陽性包涵體,并出現(xiàn)該蛋白從核內(nèi)到核外的異常分布。TDP-43由位于人類1號染色體1p36.2上的TARDBP(transactive responseDNA binding protein)基因的6個外顯子編碼。TARDBP基因序列高度保守,廣泛表達(dá)于多種組織。
　　 在后續(xù)的研究中證實(shí),TDP-43在基因的表達(dá)調(diào)控方面起著重要作用,包括:參與剪切囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)基因及載脂蛋白AⅡ(ApoA-Ⅱ)基因;通過

3、富含甘氨酸的C末端與核內(nèi)不均一糖核蛋白(hnRNP)家族成員結(jié)合從而影響外顯子跳躍接拼(exon skipping)、抑制剪接活性;與運(yùn)動神經(jīng)元生存蛋白作用為核體提供支架;參與調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性、microRNA的生物合成、細(xì)胞凋亡和分裂;可能是調(diào)節(jié)神經(jīng)元可塑性的神經(jīng)元活性反應(yīng)因子等。
　　 近兩年來,數(shù)個研究小組先后在不同人群的家族性ALS(familial ALS,FALS)和散發(fā)性ALS(sporadic ALS,SALS

4、)患者中發(fā)現(xiàn)了TARDBP基因的30多種突變,尤其以TDP-43Q331K與散發(fā)性ALS和TDP-43M337V與家族型ALS的相關(guān)關(guān)系研究較多,種種證據(jù)都提示TARDBP基因的異常與ALS的發(fā)生發(fā)展可能潛在相關(guān),因此對這一基因功能及致病機(jī)制的研究也逐步深入。
　　 本實(shí)驗(yàn)室已做的研究證實(shí),在轉(zhuǎn)染TDP-43 Q331K、M337V突變位點(diǎn)的運(yùn)動神經(jīng)元細(xì)胞系(motor neuron-like cell line,簡稱NSC34

5、)出現(xiàn)比轉(zhuǎn)染Empty vector、TDP-43 Wide type組顯著的氧化損傷、線粒體功能的障礙。
　　 白藜蘆醇(Resveratrol,簡稱Res)最早是由葡萄的皮和種子中提取的一種植物抗毒素,化學(xué)名稱為3,4',5-三羥基-1,2-二苯乙烯(亦稱芪三酚),是含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物,其具有多種生物學(xué)活性:如抗氧化作用,神經(jīng)保護(hù)作用,抗腫瘤增殖作用,心血管保護(hù)作用,激活延壽基因等作用。研究證實(shí),白藜蘆醇上述生

6、物學(xué)活性中,最受關(guān)注的是抗氧化清除自由基和神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 本研究應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43 Q331K和TDP-43 M337V的NSC34細(xì)胞系作為ALS的細(xì)胞模型,深入研究不同濃度白藜蘆醇對轉(zhuǎn)染TDP-43突變位點(diǎn)的NSC34細(xì)胞系的作用。以細(xì)胞增殖速度和細(xì)胞總體損傷狀況為切入點(diǎn),尋求白藜蘆醇對轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC34細(xì)胞的保護(hù)濃度。
　　 目的:探索穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC34細(xì)胞系的培養(yǎng)方法;利用穩(wěn)定

7、轉(zhuǎn)染TDP-43 Q331K和TDP-43 M337V的NSC34細(xì)胞系作為ALS的細(xì)胞模型,以此模型為基礎(chǔ),研究白藜蘆醇干預(yù)后細(xì)胞的變化,探討白藜蘆醇對轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC34細(xì)胞的保護(hù)濃度。
　　 方法:參照NSC34細(xì)胞細(xì)胞株的培養(yǎng)程序,將本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC34細(xì)胞系進(jìn)行復(fù)蘇、傳代、消化、凍存等,觀察其生長和增殖變化。在成功培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC34細(xì)胞基礎(chǔ)上,于傳代24小時后進(jìn)行換液

8、,待細(xì)胞恢復(fù)6-12小時后,將細(xì)胞分為對照組和Res干預(yù)組,Res干預(yù)組分別給予Res1、5和25μmol/L,作用24小時,用四甲基噻唑藍(lán)(MTT)法進(jìn)行細(xì)胞活力分析;收集各組培養(yǎng)液,測定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的含量。
　　 結(jié)果:(1)成功培養(yǎng)了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Empty vector、TDP-43 Wide type、TDP-43 Q331K、TDP-43 M337V四個NSC34細(xì)胞系,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好;(

9、2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC34細(xì)胞系在給予Res作用24小時后,倒置相差顯微鏡下觀察,1和5μmol/L干預(yù)組各組細(xì)胞形態(tài)可見突起細(xì)長光滑,彼此間可見豐富的聯(lián)系,胞體圓潤、折光性強(qiáng)、貼壁能力好;Res25μmol/L干預(yù)組可見各組細(xì)胞突起短,細(xì)胞彼此間多形成聚集,胞體皺縮、折光性差甚至成球形亮點(diǎn)、貼壁能力差;(3)給予Resl、5μmol/L作用24小時后,較未干預(yù)組和Res25μmol/L干預(yù)組細(xì)胞增殖程度明顯升高、培養(yǎng)液LDH

10、水平明顯下降,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);(4)給予Res25μmol/L作用24小時后,較對照組和Res1、5μmol/L干預(yù)組細(xì)胞增殖程度明顯降低、LDH明顯升高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);
　　 結(jié)論:進(jìn)一步探索了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的四個細(xì)胞系作為ALS的體外細(xì)胞模型的培養(yǎng)方法;低濃度的白藜蘆醇可促進(jìn)NSC34細(xì)胞的增殖,降低培養(yǎng)液中LDH含量,表明低濃度白藜蘆醇對轉(zhuǎn)染TDP-43的NSC34細(xì)胞起到保護(hù)的作用,高濃度的白