伴t(11;21)(q12;q22)的急性髓系白血病融合基因的克隆及初步功能研究.pdf

1、蘇州大學(xué)博士學(xué)位論文伴t（1121）（q12q22）的急性髓系白血病融合基因的克隆及初步功能研究姓名：戴海萍申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)（血液學(xué)）指導(dǎo)教師：薛永權(quán)20080401伴t(1l；21q12；q22)的急性髓系白血病融合基因的克隆及初步功能研究中文摘要驗均獲得患者知情同意。2采用3cDNA末端快速擴(kuò)增(3RapidAmplificationofeDNAEnds，3RACE)技術(shù)克隆該易位中AMLl的新伙伴基因(位于1lql2

2、的LPXN基因)；通過RTPCR以AMLl和LPXN基因特異性引物從患者骨髓標(biāo)本擴(kuò)增融合基因AMLlLPXN及LPXNAMLl轉(zhuǎn)錄本；設(shè)計同一基因位于易位斷裂點兩側(cè)的引物以RTPCR檢測患者未被累及的AMLl及LPXN等位基因的表達(dá)；根據(jù)后續(xù)功能研究的需要分別將AMLIB、LPXN、AMLlLPXN(代表轉(zhuǎn)錄本AL、ALs)及LPXNAMLI的全長編碼區(qū)(codingsequence，CDS)克隆到真核表達(dá)載體pEGFPN1及pcDNA

3、31／myehisB，將CBFl3全長CDS分別克隆到pDsRed2C1及peDNA31／mychisB載體。所構(gòu)建的全部克隆均送測序鑒定。3采用瞬時轉(zhuǎn)染觀察野生型AMLlB、CBFl3、LPXN及融合基因AL、ALs、LPXNAMLl翻譯成的蛋白在NIH3T3細(xì)胞中的亞定位。4利用電泳遷移率實驗(electrophorefiemobilityshiftassayEMSA)觀察融合蛋白AL、ALs與含AMLl核心序列的DNA探針的結(jié)合；

4、采用熒光素酶報告基因?qū)嶒炗^察融合蛋白對野生型AMLlB轉(zhuǎn)錄活性的影響。5篩選穩(wěn)定高表達(dá)LPXN基因及融合基因AL、ALs、LPXNAMLl的NIH3T3細(xì)胞，通過繪制生長曲線、軟瓊脂集落形成實驗和BALB／e裸鼠皮下成瘤實驗觀察這些基因?qū)φIH3T3細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化能力。結(jié)果1常規(guī)核型分析從該例患者骨髓標(biāo)本檢測到一種新的染色體異常：t(11；21)(q173；q22)，其經(jīng)PHA刺激的外周血標(biāo)本為正常核型。染色體涂染及MFISH證實1